Este protocolo proporciona un método inmunohistoquímico detallado para identificar, validar y atacar caspasas funcionalmente relevantes en tejidos complejos. La principal ventaja de esta técnica es que permite interrogar las funciones específicas de caspasa-9 apoptóticas y no apoptóticas de tipo celular y se puede aplicar a otros tejidos complejos y caspasas de interés. Comprender las funciones de las caspasas puede ayudar a ampliar el conocimiento actual en biología celular y también puede ser ventajoso para identificar posibles objetivos terapéuticos debido a su participación en la enfermedad.
Comience a cuantificar los niveles de caspasa utilizando imágenes de microscopía confocal de secciones retinianas teñidas. Para ello, arrastre los archivos de imagen de los canales 405, 470, 555 y 640 a la consola de Fiji. Haga clic en las pestañas Imagen, Color y Combinar canales para asignar colores a los archivos.
A continuación, comprima la pila Z haciendo clic en la pila de imágenes y el proyecto Z. Seleccione el tipo de proyección como intensidad máxima. Abra la interfaz del canal haciendo clic en la imagen seguida de la herramienta del canal de color.
A continuación, abra la interfaz de brillo y contraste. Para seleccionar los parámetros por canal, vaya a la pestaña del canal y elija un canal. Coloque el cursor encima del fondo y anote el valor del píxel.
Luego coloque el cursor en la celda expresada por la caspasa y anote el valor del píxel. Para probar los parámetros, vaya a la interfaz de brillo y contraste y haga clic en seleccionar. Introduzca el valor mínimo mostrado o el valor de píxeles de la celda expresada por la caspasa.
A continuación, introduzca el valor máximo mostrado o el valor del píxel de fondo antes de hacer clic en Aceptar. Elija las imágenes aleatorias del tejido cegado y repita la selección de parámetros por canal para probar los parámetros de todos los canales. Una vez establecidos los parámetros, abra los archivos de imagen y comprima la pila Z.
Agregue los parámetros de brillo y contraste para el canal de caspasa y la isolectina para el canal marcador vascular. Utilice la herramienta de puntos y cuantifique el número de áreas vasculares positivas utilizando la colocalización del marcador vascular con expresión de caspasa como lectura de áreas positivas. Luego, utilizando ganchos como marcador de áreas neuronales positivas, cuantificar el número de áreas vasculares positivas.
Anote los valores de una hoja de cálculo por imagen y promedie los valores por sección. Promedie los valores de sección, que serán la lectura por ojo. El protocolo identificó la localización celular de las caspasas y las capas neuronales de la retina en las que se expresan las caspasas.
La sección transversal retiniana permitió la visualización de los núcleos retinianos en la capa ganglionar retiniana o RGL, capa internuclear o INL, y la capa nuclear externa o ONL cuando se tiñe con ganchos. En la sección transversal, los vasos sanguíneos retinianos aparecieron desconectados y separados suministrando las capas plexiformes entre la RGL y la INL y entre la INL y la ONL. Las secciones transversales de la retina también identificaron la caspasa-9 altamente regulada, un día después de la oclusión de la vena retiniana.
La inhibición de la caspasa-9 fue más efectiva para reducir la expresión neuronal de caspasa-7 en ratones knockout de células endoteliales, lo que validó la relevancia funcional de la caspasa-9 endotelial. El análisis representativo mostró que la inhibición de la actividad de la caspasa-9 bloqueó farmacológicamente la expresión de caspasa-7 después de la oclusión de la vena retiniana. El éxito de la técnica se basa en la preparación cuidadosa del tejido, así como en la IHQ y las imágenes microscópicas para garantizar la consistencia, validez y confiabilidad de los datos.
Este método podría combinarse con el análisis western blotting para la comparación semicuantitativa de la señalización de caspasas. La técnica proporcionó los pasos para interrogar la eficacia de un enfoque terapéutico dirigido a la caspasa-9 activa en la OVR. Este enfoque también se puede aplicar a otros tejidos, incluido el cerebro.
