Ce protocole fournit une méthode immunohistochimique détaillée pour identifier, valider et cibler les caspases fonctionnellement pertinentes dans les tissus complexes. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet l’interrogation des fonctions apoptotiques et non apoptotiques de caspase-9 spécifiques au type cellulaire et peut être appliquée à d’autres tissus complexes et caspases d’intérêt. Comprendre les fonctions des caspases peut aider à élargir les connaissances actuelles en biologie cellulaire et peut également être avantageux pour identifier des cibles thérapeutiques potentielles en raison de leur implication dans la maladie.
Commencez à quantifier les niveaux de caspases à l’aide d’images de microscopie confocale de coupes rétiniennes colorées. Pour ce faire, faites glisser les fichiers image des canaux 405, 470, 555 et 640 vers la console des Fidji. Cliquez sur les onglets Image, Couleur et Fusionner les couches pour attribuer des couleurs aux fichiers.
Compressez ensuite la pile Z en cliquant sur la pile d’images et le projet Z. Sélectionnez le type de projection comme intensité maximale. Ouvrez l’interface de la chaîne en cliquant sur l’image suivie de l’outil de la chaîne de couleur.
Ensuite, ouvrez l’interface de luminosité et de contraste. Pour sélectionner les paramètres par canal, allez dans l’onglet de la chaîne et choisissez une chaîne. Placez le curseur au-dessus de l’arrière-plan et annotez la valeur en pixels.
Placez ensuite le curseur sur la cellule exprimée en caspase et annotez la valeur des pixels. Pour tester les paramètres, accédez à l’interface de luminosité et de contraste et cliquez sur Sélectionner. Branchez la valeur minimale affichée ou la valeur en pixels de la cellule exprimée en caspase.
Branchez ensuite la valeur maximale affichée ou la valeur du pixel d’arrière-plan avant de cliquer sur OK. Choisissez les images aléatoires à partir de tissus en aveugle et répétez la sélection des paramètres par canal pour tester les paramètres de tous les canaux. Une fois les paramètres définis, ouvrez les fichiers image et compressez la pile Z.
Ajouter les paramètres de luminosité et de contraste pour le canal caspase et l’isolectine pour le canal marqueur vasculaire. Utilisez l’outil de point et quantifiez le nombre de zones vasculaires positives en utilisant la colocalisation du marqueur vasculaire avec l’expression de la caspase comme lecture des zones positives. Ensuite, en utilisant des crochets comme marqueur des zones neuronales positives, quantifier le nombre de zones vasculaires positives.
Annotez les valeurs d’une feuille de calcul par image et faites la moyenne des valeurs par section. Faites la moyenne des valeurs de section, qui seront la lecture par œil. Le protocole a identifié la localisation cellulaire des caspases et des couches rétiniennes neuronales dans lesquelles les caspases sont exprimées.
La section efficace rétinienne a permis la visualisation des noyaux rétiniens dans la couche ganglionnaire rétinienne ou RGL, couche internucléaire ou INL, et la couche nucléaire externe ou ONL lorsqu’elle est colorée avec des crochets. Dans la coupe transversale, les vaisseaux sanguins rétiniens semblaient déconnectés et séparés alimentant les couches plexiformes entre le RGL et l’INL et entre l’INL et l’ONL. Les coupes transversales rétiniennes ont également identifié la caspase-9 hautement régulée, un jour après l’occlusion veineuse rétinienne.
L’inhibition de la caspase-9 était plus efficace pour réduire l’expression neuronale de la caspase-7 chez les souris knockout des cellules endothéliales, ce qui a validé la pertinence fonctionnelle de la caspase-9 endothéliale. L’analyse représentative a montré que l’inhibition de l’activité de la caspase-9 bloquait pharmacologiquement l’expression de la caspase-7 après l’occlusion veineuse rétinienne. Le succès de la technique repose sur une préparation minutieuse des tissus ainsi que sur l’IHC et l’imagerie microscopique pour assurer la cohérence, la validité et la fiabilité des données.
Cette méthode pourrait être combinée avec l’analyse Western blot pour une comparaison semi-quantitative de la signalisation des caspases. La technique a fourni les étapes pour interroger l’efficacité d’une approche thérapeutique ciblant la caspase-9 active dans l’OVR. Cette approche peut également être appliquée à d’autres tissus, y compris le cerveau.
