Bu protokol, kompleks dokulardaki fonksiyonel olarak ilgili kaspazları tanımlamak, doğrulamak ve hedeflemek için ayrıntılı bir immünohistokimyasal yöntem sağlar. Bu tekniğin temel avantajı, hücre tipine özgü apoptotik ve apoptotik olmayan kaspaz-9 fonksiyonlarının sorgulanmasını sağlaması ve ilgilenilen diğer kompleks dokulara ve kaspazlara uygulanabilmesidir. Kaspazların fonksiyonlarını anlamak, hücre biyolojisindeki mevcut bilgilerin genişletilmesine yardımcı olabilir ve ayrıca hastalığa katılımları nedeniyle potansiyel terapötik hedefleri belirlemek için avantajlı olabilir.
Lekeli retina kesitlerinin konfokal mikroskopi görüntülerini kullanarak kaspaz seviyelerini ölçmeye başlayın. Bunu yapmak için 405, 470, 555 ve 640 kanallarının görüntü dosyalarını Fiji'nin konsoluna sürükleyin. Dosyalara renk atamak için resim, renk ve kanalları birleştir sekmelerini tıklatın.
Ardından, görüntü yığınını ve Z projesini tıklatarak Z yığınını sıkıştırın. Projeksiyon türünü maksimum yoğunluk olarak seçin. Resmin ardından renk kanalının aracını tıklayarak kanalın arayüzünü açın.
Ardından, parlaklık ve kontrast arayüzünü açın. Kanal başına parametreleri seçmek için kanalın sekmesine gidin ve bir kanal seçin. İmleci arka planın üzerine getirin ve piksel değerine açıklama ekleyin.
Ardından imleci kaspaz ifade edilen hücrenin üzerine getirin ve piksel değerine açıklama ekleyin. Parametreleri test etmek için parlaklık ve karşıtlık arabirimine gidin ve seç'i tıklatın. Görüntülenen minimum değeri veya kaspaz ifade edilen hücrenin piksel değerini takın.
Ardından, Tamam'ı tıklamadan önce görüntülenen maksimum değeri veya arka plan pikseli değerini takın. Kör dokudan rastgele görüntüleri seçin ve tüm kanalların parametrelerini test etmek için kanal başına parametre seçimini tekrarlayın. Parametreler ayarlandıktan sonra, görüntü dosyalarını açın ve Z yığınını sıkıştırın.
Kaspaz kanalı için parlaklık ve kontrast parametrelerini ve vasküler belirteç kanalı için izolektini ekleyin. Nokta aracını kullanın ve pozitif alanların okunması olarak vasküler belirtecin kaspaz ekspresyonu ile kolokalizasyonunu kullanarak pozitif vasküler alanların sayısını sayın. Daha sonra kancaları pozitif nöronal alanların belirteci olarak kullanarak, pozitif vasküler alanların sayısını ölçün.
Resim başına e-tablodaki değerlere açıklama ekleyin ve değerlerin ortalamasını bölüme göre alın. Bölüm değerlerinin ortalaması, göz başına okuma olacaktır. Protokol, kaspazların hücresel lokalizasyonunu ve kaspazların eksprese edildiği nöronal retinal tabakaları tanımladı.
Retinal kesit, retinal ganglion tabakasında veya RGL, Internuclear tabakasında veya INL'de retina çekirdeklerinin ve kancalarla boyandığında dış nükleer tabakanın veya ONL'nin görüntülenmesine izin verdi. Enine kesitte, retinal kan damarlarının bağlantısı kesilmiş ve RGL ile INL arasındaki ve INL ile ONL arasındaki pleksiform tabakaları besleyen ayrı görünüyordu. Retinal kesitler ayrıca retinal ven tıkanıklığından bir gün sonra yüksek oranda düzenlenmiş kaspaz-9'u da tanımladı.
Kaspaz-9 inhibisyonu, endotel hücreli nakavt farelerde nöronal kaspaz-7 ekspresyonunu azaltmada daha etkiliydi ve bu da endotel kaspaz-9'un fonksiyonel uygunluğunu doğruladı. Temsili analiz, kaspaz-9 aktivitesinin inhibisyonunun, retinal ven tıkanıklığı sonrası kaspaz-7 ekspresyonunu farmakolojik olarak bloke ettiğini göstermiştir. Tekniğin başarısı, verilerin tutarlılığını, geçerliliğini ve güvenilirliğini sağlamak için dikkatli doku hazırlığının yanı sıra IHC ve mikroskobik görüntülemeye dayanmaktadır.
Bu yöntem, kaspaz sinyallemesinin yarı kantitatif karşılaştırması için batı blotlama analizi ile birleştirilebilir. Teknik, RVO'da aktif kaspaz-9'u hedef alan terapötik bir yaklaşımın etkinliğini sorgulamak için adımlar sağlamıştır. Bu yaklaşım beyin de dahil olmak üzere diğer dokulara da uygulanabilir.
