يوفر هذا البروتوكول طريقة كيميائية مناعية مفصلة لتحديد الكاسباسات ذات الصلة وظيفيا في الأنسجة المعقدة والتحقق من صحتها واستهدافها. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تمكن من استجواب وظائف كاسباز -9 الخاصة بنوع الخلية وغير موت الخلايا المبرمج ويمكن تطبيقها على الأنسجة المعقدة الأخرى والكاسباز ذات الأهمية. يمكن أن يساعد فهم وظائف الكاسباز في توسيع المعرفة الحالية في بيولوجيا الخلية ويمكن أن يكون مفيدا أيضا لتحديد الأهداف العلاجية المحتملة بسبب تورطها في المرض.
ابدأ في تحديد مستويات الكاسباز باستخدام صور الفحص المجهري متحد البؤر لأقسام الشبكية الملطخة. للقيام بذلك، اسحب ملفات الصور الخاصة بقنوات 405 و470 و555 و640 إلى وحدة تحكم فيجي. انقر فوق علامات تبويب الصورة واللون ودمج القنوات لتعيين ألوان للملفات.
ثم ضغط مكدس Z بالنقر فوق مكدس الصور ومشروع Z. حدد نوع الإسقاط كأقصى كثافة. افتح واجهة القناة بالنقر فوق الصورة متبوعة بأداة قناة الألوان.
بعد ذلك ، افتح واجهة السطوع والتباين. لتحديد المعلمات لكل قناة، انتقل إلى علامة تبويب القناة واختر قناة واحدة. ضع المؤشر أعلى الخلفية وقم بالتعليق على قيمة البكسل.
ثم ضع المؤشر على الخلية المعبر عنها caspase وقم بالتعليق على قيمة البكسل. لاختبار المعلمات ، انتقل إلى واجهة السطوع والتباين وانقر فوق تحديد. قم بتوصيل الحد الأدنى للقيمة المعروضة أو قيمة البكسل المعبر عنها في الخلية المعبر عنها.
ثم قم بتوصيل الحد الأقصى للقيمة المعروضة أو قيمة بكسل الخلفية قبل النقر فوق موافق. اختر الصور العشوائية من الأنسجة العمياء وكرر اختيار المعلمات لكل قناة لاختبار المعلمات لجميع القنوات. بمجرد تعيين المعلمات ، افتح ملفات الصور ، وضغط مكدس Z.
أضف معلمات السطوع والتباين لقناة caspase والإيزولكتين لقناة علامة الأوعية الدموية. استخدم أداة النقطة وحدد عدد مناطق الأوعية الدموية الإيجابية باستخدام التمركز المشترك لعلامة الأوعية الدموية مع تعبير caspase كقراءة للمناطق الإيجابية. ثم باستخدام الخطافات كعلامة للمناطق العصبية الإيجابية ، حدد عدد مناطق الأوعية الدموية الإيجابية.
أضف تعليقات توضيحية إلى القيم في جدول بيانات لكل صورة وقم بحساب متوسط القيم حسب القسم. متوسط قيم القسم ، والتي ستكون القراءة لكل عين. حدد البروتوكول التوطين الخلوي للكاسباس وطبقات الشبكية العصبية التي يتم فيها التعبير عن الكاسباس.
سمح المقطع العرضي للشبكية بتصور نوى الشبكية في طبقة العقدة الشبكية أو RGL ، والطبقة بين النوى أو INL ، والطبقة النووية الخارجية أو ONL عند تلطيخها بخطافات. في المقطع العرضي ، بدت الأوعية الدموية في شبكية العين منفصلة ومنفصلة لتزويد الطبقات الضفيرية بين RGL و INL وبين INL و ONL. حددت المقاطع العرضية للشبكية أيضا كاسباس -9 عالي التنظيم ، بعد يوم واحد من انسداد الوريد الشبكي.
كان تثبيط caspase-9 أكثر فعالية في تقليل التعبير العصبي caspase-7 في الفئران بالضربة القاضية للخلايا البطانية التي أثبتت صحة الأهمية الوظيفية ل caspase-9 البطانية. أظهر التحليل التمثيلي أن تثبيط نشاط caspase-9 منع دوائيا تعبير caspase-7 بعد انسداد الوريد الشبكي. يعتمد نجاح هذه التقنية على التحضير الدقيق للأنسجة بالإضافة إلى IHC والتصوير المجهري لضمان اتساق البيانات وصلاحيتها وموثوقيتها.
يمكن دمج هذه الطريقة مع تحليل النشاف الغربي للمقارنة شبه الكمية لإشارات caspase. قدمت هذه التقنية خطوات لاستجواب فعالية النهج العلاجي الذي يستهدف caspase-9 النشط في RVO. يمكن أيضا تطبيق هذا النهج على الأنسجة الأخرى ، بما في ذلك الدماغ.
