Этот протокол обеспечивает подробный иммуногистохимический метод идентификации, проверки и нацеливания функционально значимых каспаз в сложных тканях. Основным преимуществом данной методики является то, что она позволяет опрашивать специфические апоптотические и неапоптотические функции каспазы-9 клеточного типа и может применяться к другим сложным тканям и каспазам, представляющим интерес. Понимание функций каспаз может помочь расширить современные знания в области клеточной биологии, а также может быть выгодным для выявления потенциальных терапевтических целей из-за их участия в заболевании.
Начните количественную оценку уровней каспазы, используя конфокальные микроскопические изображения окрашенных участков сетчатки. Для этого перетащите файлы изображений каналов 405, 470, 555 и 640 на консоль Fiji. Щелкните вкладки изображений, цветов и каналов слияния, чтобы назначить цвета файлам.
Затем сожмите стек Z, щелкнув стек изображений и проект Z. Выберите тип проекции как максимальную интенсивность. Откройте интерфейс канала, щелкнув изображение, а затем инструмент цветного канала.
Затем откройте интерфейс яркости и контрастности. Чтобы выбрать параметры для каждого канала, перейдите на вкладку канала и выберите один канал. Поместите курсор поверх фона и аннотируйте значение пикселя.
Затем наведите курсор на ячейку, выраженную в каспасе, и аннотируйте значение пикселя. Чтобы проверить параметры, перейдите в интерфейс яркости и контрастности и нажмите кнопку Выбрать. Подключите минимальное отображаемое значение или значение пикселя ячейки, выраженной в каспазе.
Затем подключите максимальное отображаемое значение или значение фонового пикселя, прежде чем нажать кнопку «ОК». Выберите случайные изображения из слепой ткани и повторите выбор параметров для каждого канала, чтобы проверить параметры для всех каналов. После установки параметров откройте файлы изображений и сожмите стек Z.
Добавьте параметры яркости и контрастности для канала каспазы и изолектина для сосудистого маркерного канала. Используйте точечный инструмент и количественно оцените количество положительных сосудистых областей, используя колокализацию сосудистого маркера с экспрессией каспазы в качестве считывания положительных областей. Затем, используя крючки в качестве маркера положительных нейронных областей, количественно оцените количество положительных сосудистых областей.
Аннотирование значений в электронной таблице для каждого изображения и усреднение значений по разделам. Усредните значения секций, которые будут считываться на глаз. Протокол определил клеточную локализацию каспаз и нейронных слоев сетчатки, в которых экспрессируются каспазы.
Поперечное сечение сетчатки позволило визуализировать ядра сетчатки в ганглиозном слое сетчатки или RGL, межядерном слое или INL, а также внешний ядерный слой или ONL при окрашивании крючками. В поперечном сечении кровеносные сосуды сетчатки оказались разъединенными и раздельными, снабжающими плексиформные слои между RGL и INL и между INL и ONL. Поперечные сечения сетчатки также идентифицировали высокорегулируемую каспазу-9, через день после окклюзии вен сетчатки.
Ингибирование каспазы-9 было более эффективным при снижении экспрессии нейрональной каспазы-7 у нокаутирующих мышей эндотелиальных клеток, что подтвердило функциональную значимость эндотелиальной каспазы-9. Репрезентативный анализ показал, что ингибирование активности каспазы-9 фармакологически блокировало экспрессию каспазы-7 после окклюзии вен сетчатки. Успех метода зависит от тщательной подготовки тканей, а также IHC и микроскопической визуализации для обеспечения согласованности, достоверности и надежности данных.
Этот метод может быть объединен с анализом вестерн-блоттинга для полуколичественного сравнения кассазной сигнализации. Методика обеспечила шаги для опроса эффективности терапевтического подхода, нацеленного на активную каспазу-9 в RVO. Этот подход также может быть применен к другим тканям, включая мозг.
