Questo protocollo fornisce un metodo immunoistochimico dettagliato per identificare, convalidare e indirizzare le caspasi funzionalmente rilevanti nei tessuti complessi. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente l'interrogazione delle funzioni di caspasi-9 apoptotiche e non apoptotiche specifiche del tipo cellulare e può essere applicato ad altri tessuti complessi e caspasi di interesse. Comprendere le funzioni delle caspasi può aiutare ad ampliare le attuali conoscenze in biologia cellulare e può anche essere vantaggioso per identificare potenziali bersagli terapeutici a causa del loro coinvolgimento nella malattia.
Inizia a quantificare i livelli di caspasi usando immagini al microscopio confocale di sezioni retiniche colorate. Per fare ciò, trascina i file immagine dei canali 405, 470, 555 e 640 sulla console delle Fiji. Fare clic sulle schede immagine, colore e unisci canali per assegnare colori ai file.
Quindi comprimere lo stack Z facendo clic sullo stack di immagini e sul progetto Z. Selezionare il tipo di proiezione come intensità massima. Apri l'interfaccia del canale facendo clic sull'immagine seguita dallo strumento del canale di colore.
Quindi, apri l'interfaccia di luminosità e contrasto. Per selezionare i parametri per canale, vai alla scheda del canale e scegli un canale. Posiziona il cursore sopra lo sfondo e annota il valore in pixel.
Quindi posizionare il cursore sulla cella caspasi espressa e annotare il valore dei pixel. Per testare i parametri, vai all'interfaccia di luminosità e contrasto e fai clic su Seleziona. Inserire il valore minimo visualizzato o il valore in pixel della cella espressa dalla caspasi.
Quindi collegare il valore massimo visualizzato o il valore in pixel di sfondo prima di fare clic su OK. Scegli le immagini casuali dal tessuto in cieco e ripeti la selezione dei parametri per canale per testare i parametri per tutti i canali. Una volta impostati i parametri, aprire i file di immagine e comprimere lo stack Z.
Aggiungere i parametri di luminosità e contrasto per il canale caspasi e l'isolectina per il canale marcatore vascolare. Utilizzare lo strumento puntuale e quantificare il numero di aree vascolari positive utilizzando la colocalizzazione del marcatore vascolare con espressione di caspasi come lettura delle aree positive. Quindi, utilizzando i ganci come marcatore di aree neuronali positive, quantificare il numero di aree vascolari positive.
Annotare i valori su un foglio di calcolo per immagine e calcolare la media dei valori per sezione. Calcola la media dei valori delle sezioni, che saranno la lettura per occhio. Il protocollo ha identificato la localizzazione cellulare delle caspasi e degli strati retinici neuronali in cui le caspasi sono espresse.
La sezione trasversale retinica ha permesso la visualizzazione dei nuclei retinici nello strato gangliare retinico o RGL, strato internucleare o INL, e lo strato nucleare esterno o ONL quando colorato con ganci. Nella sezione trasversale, i vasi sanguigni retinici apparivano scollegati e separati fornendo gli strati plessiformi tra RGL e INL e tra INL e ONL. Le sezioni trasversali retiniche hanno anche identificato la caspasi-9 altamente regolata, un giorno dopo l'occlusione venosa retinica.
L'inibizione della caspasi-9 è stata più efficace nel ridurre l'espressione della caspasi-7 neuronale nei topi knockout delle cellule endoteliali che hanno convalidato la rilevanza funzionale della caspasi-9 endoteliale. L'analisi rappresentativa ha mostrato che l'inibizione dell'attività della caspasi-9 bloccava farmacologicamente l'espressione della caspasi-7 dopo l'occlusione venosa retinica. Il successo della tecnica si basa su un'attenta preparazione dei tessuti, nonché sull'IHC e sull'imaging microscopico per garantire coerenza, validità e affidabilità dei dati.
Questo metodo potrebbe essere combinato con l'analisi western blotting per il confronto semi-quantitativo della segnalazione delle caspasi. La tecnica ha fornito i passaggi per interrogare l'efficacia di un approccio terapeutico mirato alla caspasi-9 attiva nella RVO. Questo approccio può essere applicato anche ad altri tessuti, incluso il cervello.
