Este protocolo fornece um método imuno-histoquímico detalhado para identificar, validar e direcionar caspases funcionalmente relevantes em tecidos complexos. A principal vantagem desta técnica é que permite a interrogação de funções específicas da caspase-9 apoptótica e não apoptótica do tipo celular e pode ser aplicada a outros tecidos complexos e caspases de interesse. Compreender as funções das caspases pode ajudar a expandir o conhecimento atual em biologia celular e também pode ser vantajoso para identificar potenciais alvos terapêuticos devido ao seu envolvimento na doença.
Comece a quantificar os níveis de caspase usando imagens de microscopia confocal de cortes corados da retina. Para fazer isso, arraste os arquivos de imagem de 405, 470, 555 e 640 canais para o console de Fiji. Clique nas guias de imagem, cor e mesclagem de canais para atribuir cores aos arquivos.
Em seguida, compacte a pilha Z clicando na pilha de imagens e no projeto Z. Selecione o tipo de projeção como intensidade máxima. Abra a interface do canal clicando na imagem seguida da ferramenta do canal de cores.
Em seguida, abra a interface de brilho e contraste. Para selecionar os parâmetros por canal, vá para a guia do canal e escolha um canal. Coloque o cursor sobre o plano de fundo e anote o valor do pixel.
Em seguida, coloque o cursor na célula expressa em caspase e anote o valor do pixel. Para testar os parâmetros, vá para a interface de brilho e contraste e clique em selecionar. Conecte o valor mínimo exibido ou o valor de pixel da célula expressa em caspase.
Em seguida, conecte o valor máximo exibido ou o valor do pixel de plano de fundo antes de clicar em OK. Escolha as imagens aleatórias do tecido cego e repita a seleção de parâmetros por canal para testar os parâmetros para todos os canais. Depois que os parâmetros estiverem definidos, abra os arquivos de imagem e compacte a pilha Z.
Adicione os parâmetros de brilho e contraste para o canal caspase e a isolectina para o canal marcador vascular. Use a ferramenta pontual e quantifique o número de áreas vasculares positivas usando a colocalização do marcador vascular com expressão de caspase como leitura de áreas positivas. Em seguida, usando ganchos como marcador de áreas neuronais positivas, quantifique o número de áreas vasculares positivas.
Anote os valores em uma planilha por imagem e faça a média dos valores por seção. Média dos valores de seção, que será a leitura por olho. O protocolo identificou a localização celular das caspases e das camadas neuronais da retina nas quais as caspases são expressas.
A secção transversal da retina permitiu a visualização dos núcleos da retina na camada ganglionar da retina ou RGL, camada internuclear ou INL, e da camada nuclear externa ou ONL quando corada com ganchos. Na seção transversal, os vasos sanguíneos da retina apareceram desconectados e separados suprindo as camadas plexiformes entre o RGL e o INL e entre o INL e o ONL. Cortes transversais da retina também identificaram a caspase-9 altamente regulada, um dia após a oclusão da veia retiniana.
A inibição da caspase-9 foi mais eficaz na redução da expressão neuronal da caspase-7 em camundongos knockout de células endoteliais, o que validou a relevância funcional da caspase-9 endotelial. A análise representativa mostrou que a inibição da atividade da caspase-9 bloqueou farmacologicamente a expressão da caspase-7 após a oclusão da veia retiniana. O sucesso da técnica depende de uma cuidadosa preparação tecidual, bem como de IHC e imagens microscópicas para garantir a consistência, validade e confiabilidade dos dados.
Este método pode ser combinado com a análise de western blotting para comparação semiquantitativa da sinalização da caspase. A técnica forneceu os passos para interrogar a eficácia de uma abordagem terapêutica visando a caspase-9 ativa na RVO. Esta abordagem também pode ser aplicada a outros tecidos, incluindo o cérebro.
