Este protocolo es clave para generar cepas que puedan ser utilizadas en ensayos de cribado de alto rendimiento para evaluar el potencial y la actividad tradicional de las moléculas La demostración del procedimiento estará a cargo de Juana Quintero y Laura Pineda, asistentes de investigación de mi laboratorio. Para empezar, amplifique el gen diana utilizando una polimerasa de alta fidelidad para preservar la secuencia codificante. Agregue los cebadores a la mezcla de reacción en una concentración final de 0,2 micromolares y ejecute un protocolo de ciclado de PCR como se describe en el manuscrito.
Purifique el fragmento de PCR amplificado utilizando un kit de purificación de productos de PCR convencional. Para recortar los extremos del producto de PCR eGFP, configure una reacción con la enzima Kpn I de acuerdo con las instrucciones del fabricante e incube a 37 grados centígrados durante una hora. Luego agregue 100 milimolares de cloruro de sodio y 10 unidades de Bgl II a la reacción e incube durante 15 minutos.
Después de la digestión, purifique la reacción como se mostró anteriormente. A continuación, digiera el vector de expresión de pLEXSY con Bgl II y Kpl I siguiendo la digestión secuencial como se demostró anteriormente. Ligar 100 nanogramos de vector pLEXSY digerido y 28 nanogramos de eGFP digerido en una reacción de 20 microlitros que contiene tampón ligasa y tres unidades de ADN ligasa T4.
Incubar durante la noche a cuatro grados centígrados. Al final de la incubación, transforme las células competentes de Escherichia coli con el producto de ligadura utilizando protocolos de transformación estándar. Coloque las células transformadas en agar ampicilina LB e incube durante 24 horas a 30 grados centígrados para seleccionar clones recombinantes.
Después de examinar las colonias, purifique el ADN plasmídico de un clon positivo para su posterior transfección utilizando un kit comercial de aislamiento de plásmidos. Para producir fragmentos linealizados del plásmido, tome al menos 10 microgramos del plásmido pLEXSY eGFP purificado y digieralo con SWA1 durante tres o cuatro horas a 25 grados centígrados. Al final de la incubación, el calor inactiva el producto de digestión a 65 grados centígrados durante 20 minutos.
A continuación, ejecute el producto de digestión en electroforesis en gel de agarosa para separar los fragmentos resultantes. Purifique el casete de expresión con un kit comercial de extracción de gel de agarosa de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Cultive los cultivos de parásitos hasta que haya suficientes promastigotes en fase logarítmica o en fase estacionaria temprana.
Agrupe el contenido de varios matraces de cultivo si es necesario. Centrifugar el cultivo del parásito a 2.000 G durante tres minutos a temperatura ambiente. Vuelva a suspender el pellet en un tampón de electroporación a cuatro grados centígrados para obtener una concentración de uno por 10 al octavo parásitos por mililitro y manténgalo en hielo durante 10 minutos.
Al mismo tiempo, los tubos de preenfriamiento con 2 a 10 microgramos de pLEXSY eGFP linealizado se construyen en 50 microlitros de agua o 10 milimolares de tampón tris con pH 8,0 y cubetas de electroporación de dos milímetros de diámetro. A continuación, agregue 350 microlitros de parásitos preenfriados al tubo con el plásmido linealizado y transfiera los 400 microlitros completos a la cubeta de electroporación en hielo. Electroporar las células parásitas con plásmido y, en paralelo, las células parásitas sin ADN plasmídico como control negativo.
Coloque la cubeta en hielo durante 10 minutos. Transfiera los parásitos electroporados a cinco mililitros del medio de cultivo adecuado e incube a 26 grados centígrados durante 20 horas. Aproximadamente 20 horas después de la electroporación, observar los cultivos al microscopio y añadir el antibiótico selectivo adecuado en función del plásmido pLEXSY utilizado.
Siga los cultivos microscópicamente hasta que haya una clara diferencia entre los parásitos electroporados con y sin ADN plasmídico. Para verificar la fluorescencia del parásito mediante citometría de flujo, centrifugue un mililitro del cultivo en fase estacionaria a 2.000 G durante tres minutos a temperatura ambiente. Después de lavar las celdas dos veces en PBS, vuelva a suspender el gránulo final en un mililitro de PBS.
Ejecute muestras y recoja 20.000 eventos a una velocidad de 0,5 microlitros por segundo. Establezca los valores de ganancia para los canales de dispersión directa, dispersión lateral y fluorescencia como 225,0, 200,0 y 520,0 respectivamente. Cree una puerta G1 que contenga la población de parásitos.
Filtre el canal FL1 a través de esa puerta para determinar la autofluorescencia de los promastigotes y establezca una puerta de rango G2 para el canal FL1. Ejecute los parásitos transfectados para verificar si hay fluorescencia. Registre el porcentaje de parásitos en G1 que son fluorescentes y la media de la intensidad de fluorescencia en G2. Purificar ADN genómico de dos a cinco mililitros de un cultivo de parásitos en fase estacionaria mediante extracción convencional de fenol cloroformo o con un kit comercial.
Realizar la PCR diagnóstica para pLEXSY-sat2.1 utilizando un protocolo de ciclado como se describe en el manuscrito. Después de la confirmación de la fluorescencia mediante citometría de flujo, prepare una dilución de parásitos recombinantes a una concentración de cinco promastigotes por mililitro. Agregue 100 microlitros de esta dilución en cada pocillo de una placa de 96 pocillos y deje la placa sin tocar durante al menos 12 horas.
Siga la placa microscópicamente a un aumento mínimo de 100X hasta que se detecten pocillos con crecimiento de parásitos. Cuando un pozo está lleno de parásitos, use el contenido para inocular un cultivo de cinco mililitros. Una vez que los cultivos sembrados por clones alcanzan la fase estacionaria, verifique la fluorescencia mediante citometría de flujo como se describió anteriormente.
Seleccionar clones con un 98% a 99% de parásitos fluorescentes y la mayor intensidad media de fluorescencia para ensayos in vitro e in vivo. La PCR de colonias de las células de E. coli transformadas con la construcción pLEXSY eGFP generó un producto de 859 pares de bases. La digestión total del plásmido utilizando SWA1 dio como resultado dos fragmentos, un fragmento de par de 2,9 kilobases que contiene todos los elementos necesarios para la replicación y selección en E. coli y un fragmento de siete a ocho pares de kilobases que representa el casete de expresión linealizado que se utiliza para la transfección.
El análisis de citometría de flujo reveló que el 82% de los parásitos transfectados de L. panamensis expresaron eGFP. Después de la selección policlonal, el 98,44% de los parásitos de L. donovani analizados por citometría de flujo fueron fluorescentes en comparación con el 82,0% de L. panamensis. La integración exitosa de pLEXSY eGFP en el locus de SSU dio como resultado un producto de par de 2,3 kilobases en la PCR diagnóstica.
Se seleccionaron los clones con el mayor porcentaje de parásitos fluorescentes y la intensidad media de fluorescencia para su posterior uso en ensayos de detección de fármacos. Este método permite la producción de parásitos recombinantes de Leishmania con el
