פרוטוקול זה הוא המפתח ליצירת זנים שניתן להשתמש בהם במבחני סינון בתפוקה גבוהה כדי להעריך את הפוטנציאל ואת הפעילות המסורתית של מולקולות המדגימות את ההליך חואנה קינטרו ולורה פינדה, עוזרות מחקר מהמעבדה שלי. כדי להתחיל, להגביר את גן המטרה באמצעות פולימראז נאמנות גבוהה כדי לשמר את רצף הקידוד. הוסף את הפריימרים לתמהיל התגובה בריכוז סופי של 0.2 מיקרומולר והפעל פרוטוקול מחזור PCR כמתואר בכתב היד.
טהרו את מקטע ה-PCR המוגבר באמצעות ערכת טיהור מוצר PCR קונבנציונלית. כדי לחתוך את הקצוות של מוצר eGFP PCR, להגדיר תגובה עם אנזים Kpn I על פי הוראות היצרן לדגור ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת. לאחר מכן להוסיף 100 מילימולר של נתרן כלורי ו 10 יחידות של Bgl II לתגובה לדגור במשך 15 דקות.
לאחר העיכול, לטהר את התגובה כפי שמוצג קודם לכן. לאחר מכן, לעכל וקטור ביטוי pLEXSY עם Bgl II ו- Kpl I בעקבות העיכול הרציף כפי שהודגם קודם לכן. Ligate 100 ננוגרם של וקטור pLEXSY מעוכל ו-28 ננוגרם של eGFP מעוכל בתגובה של 20 מיקרוליטר המכילה מאגר ליגאז ושלוש יחידות של T4 DNA ligase.
דוגרים לילה בארבע מעלות צלזיוס. בסוף הדגירה, להפוך תאים מתאימים Escherichia coli עם מוצר קשירה באמצעות פרוטוקולי טרנספורמציה סטנדרטיים. לוחצים את התאים שעברו טרנספורמציה באגר אמפיצילין LB ודגרים במשך 24 שעות בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס כדי לבחור שיבוטים רקומביננטיים.
לאחר סינון המושבות, לטהר DNA פלסמיד משיבוט חיובי לצורך העברה לאחר מכן באמצעות ערכת בידוד פלסמיד מסחרית. כדי לייצר שברים ליניאריים של פלסמיד, לקחת לפחות 10 מיקרוגרם של פלסמיד pLEXSY eGFP מטוהר ולעכל אותו עם SWA1 במשך שלוש עד ארבע שעות ב 25 מעלות צלזיוס. בסוף הדגירה, חום להשבית את מוצר העיכול ב 65 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות.
לאחר מכן הפעל את מוצר העיכול אלקטרופורזה ג'ל agarose כדי להפריד את השברים המתקבלים. לטהר את קלטת הביטוי באמצעות ערכת מיצוי ג'ל אגרוז מסחרית בהתאם להוראות היצרן. לגדל את תרביות הטפילים עד שיש מספיק שלב יומן או שלב נייח מוקדם promastigotes.
אגרו את התוכן של צלוחיות תרבית מרובות במידת הצורך. צנטריפוגה תרבות הטפיל ב 2, 000 גרם במשך שלוש דקות בטמפרטורת החדר. השהה מחדש את הגלולה בחיץ אלקטרופורציה בארבע מעלות צלזיוס כדי לקבל ריכוז של אחד כפול 10 עד הטפילים השמיני למיליליטר ולשמור אותו על קרח במשך 10 דקות.
במקביל, צינורות טרום קירור עם 2 עד 10 מיקרוגרם של pLEXSY eGFP ליניארי לבנות 50 מיקרוליטר של מים או 10 מילימולרי tris buffer עם pH 8.0 ו electroporation cuvettes של שני מילימטר קוטר. לאחר מכן, להוסיף 350 מיקרוליטר של טפילים מצוננים מראש לצינור עם פלסמיד ליניארי ולהעביר את כל 400 מיקרוליטר לקובט electroporation על קרח. אלקטרופורציה תאי הטפיל עם פלסמיד ובמקביל, תאי טפיל ללא DNA פלסמיד כבקרה שלילית.
שים את cuvette על קרח במשך 10 דקות. מעבירים את הטפילים המחושמלים לחמישה מיליליטר של מדיום התרבית המתאים ודגרים בטמפרטורה של 26 מעלות צלזיוס למשך 20 שעות. כ-20 שעות לאחר האלקטרופורציה, התבוננו בתרביות תחת מיקרוסקופ והוסיפו את האנטיביוטיקה הסלקטיבית המתאימה בהתאם לפלסמיד pLEXSY בו נעשה שימוש.
עקבו אחר התרביות באופן מיקרוסקופי עד שיהיה הבדל ברור בין טפילים שהתחשמלו עם וללא DNA פלסמיד. כדי לאמת פלואורסצנטיות של הטפיל באמצעות ציטומטריית זרימה, צנטריפוגה מיליליטר אחד של תרבית הפאזה הנייחת ב 2, 000 G במשך שלוש דקות בטמפרטורת החדר. לאחר שטיפת התאים פעמיים ב-PBS, יש להשהות מחדש את הגלולה האחרונה במיליליטר אחד של PBS.
הפעל דגימות ואסוף 20, 000 אירועים במהירות של 0.5 מיקרוליטר לשנייה. הגדר ערכי רווח עבור ערוצי הפיזור קדימה, הפיזור הצידי והפלואורסצנטיות כ- 225.0, 200.0 ו- 520.0 בהתאמה. צור שער G1 המכיל את אוכלוסיית הטפילים.
סנן את ערוץ FL1 דרך שער זה כדי לקבוע את האוטופלואורסצנטיות של פרומסטיגוטים והגדר שער טווח G2 עבור ערוץ FL1. הפעל את הטפילים הנגועים כדי לוודא אם יש פלואורסצנטיות. רשום את אחוז הטפילים ב- G1 שהם פלואורסצנטיים ואת הממוצע של עוצמת הפלואורסצנטיות ב- G2. לטהר DNA גנומי משניים עד חמישה מיליליטר של תרבית טפיל פאזה נייחת על ידי מיצוי כלורופורם פנול קונבנציונלי או עם ערכה מסחרית.
בצע PCR אבחוני עבור pLEXSY-sat2.1 באמצעות פרוטוקול מחזור כמתואר בכתב היד. לאחר אישור פלואורסצנטיות באמצעות ציטומטריית זרימה, להכין דילול של טפילים רקומביננטיים בריכוז של חמישה promastigotes למיליליטר. מוסיפים 100 מיקרוליטר של דילול זה לכל באר של צלחת 96 בארות ומשאירים את הצלחת ללא הפרעה לפחות 12 שעות.
עקבו אחר הצלחת באופן מיקרוסקופי בהגדלה מינימלית של פי 100 עד לגילוי בארות עם צמיחת טפילים. כאשר באר מלאה בטפילים, השתמש בתוכן כדי לחסן תרבית של חמישה מיליליטר. ברגע שתרביות זרעי המשובטים מגיעות לשלב הנייח, יש לוודא פלואורסצנטיות באמצעות ציטומטריית זרימה כפי שתואר קודם לכן.
בחר שיבוטים עם 98% עד 99% של טפילים פלואורסצנטיים ואת עוצמת הפלואורסצנטיות הממוצעת הגבוהה ביותר עבור בדיקות in vitro ו- in vivo. PCR מושבה של תאי E.coli שעבר טרנספורמציה עם מבנה pLEXSY eGFP יצר מוצר זוג בסיס 859. העיכול הכולל של הפלסמיד באמצעות SWA1 הביא לשני שברים, שבר זוג של 2.9 קילו-בסיס המכיל את כל האלמנטים הדרושים לשכפול ובחירה ב-E.coli ומקטע זוג של שבעה עד שמונה קילו-בסיסים המייצג את קלטת הביטוי הלינארית המשמשת לטרנספקציה.
ניתוח ציטומטריית זרימה גילה כי 82% מטפילי L.panamensis הנגועים ביטאו eGFP. לאחר ברירה רב-שבטית 98.44% מהטפילים של L.donovani שנותחו על ידי ציטומטריית זרימה היו פלואורסצנטיים בהשוואה ל-82.0% של L.panamensis. השילוב המוצלח של pLEXSY eGFP לתוך מוקד SSU הביא למוצר זוג 2.3 קילו-בסיס ב-PCR האבחנתי.
שיבוטים עם האחוז הגבוה ביותר של טפילים פלואורסצנטיים ועוצמת פלואורסצנטיות ממוצעת נבחרו לשימוש נוסף בבדיקות סינון תרופות. שיטה זו מאפשרת ייצור של טפילי לישמניה רקומביננטיים עם
