이 프로토콜은 분자의 잠재력과 전통적인 활성을 평가하기 위해 고처리량 스크리닝 분석에 사용할 수 있는 균주를 생성하는 데 중요합니다. 이 절차를 시연하는 것은 내 실험실의 연구 조교인 Juana Quintero와 Laura Pineda가 될 것입니다. 먼저, 코딩 서열을 보존하기 위해 고충실도 중합효소를 사용하여 표적 유전자를 증폭합니다. 프라이머를 0.2 마이크로몰의 최종 농도로 반응 혼합물에 첨가하고 원고에 설명된 대로 PCR 사이클링 프로토콜을 실행합니다.
증폭된 PCR 단편을 통상적인 PCR 산물 정제 키트를 이용하여 정제한다. eGFP PCR 산물의 끝을 다듬기 위해 제조사의 지시에 따라 Kpn I 효소와 반응을 설정하고 섭씨 37도에서 1시간 동안 배양합니다. 그런 다음 100 밀리몰의 염화나트륨과 10 단위의 Bgl II를 반응물에 첨가하고 15 분 동안 배양한다.
소화 후 앞서 설명한대로 반응을 정제하십시오. 다음으로, 앞서 설명한 바와 같이 순차적 소화에 따라 Bgl II 및 Kpl I로 pLEXSY 발현 벡터를 분해합니다. 리가아제 완충액과 3단위의 T4 DNA 리가아제를 포함하는 20마이크로리터 반응에서 100나노그램의 소화된 pLEXSY 벡터와 28나노그램의 소화된 eGFP를 Ligate합니다.
섭씨 4도에서 하룻밤 동안 배양하십시오. 배양이 끝나면 표준 형질전환 프로토콜을 사용하여 적격한 대장균 세포를 결찰 산물로 형질전환합니다. 형질전환된 세포를 LB 암피실린 한천에 플레이트하고 섭씨 30도에서 24시간 동안 배양하여 재조합 클론을 선별합니다.
콜로니를 스크리닝한 후, 시판되는 플라스미드 분리 키트를 사용하여 후속 형질감염을 위해 양성 클론으로부터 플라스미드 DNA를 정제한다. 플라스미드의 선형화된 단편을 생산하려면 정제된 pLEXSY eGFP 플라스미드를 최소 10마이크로그램 채취하여 섭씨 25도에서 3-4시간 동안 SWA1로 분해합니다. 배양이 끝나면 섭씨 65도에서 20 분 동안 소화 생성물을 열로 비활성화합니다.
이어서, 분해 생성물을 아가로스 겔 전기영동에서 실행하여 생성된 단편을 분리한다. 발현 카세트를 제조자의 지시에 따라 상업적인 아가로스 겔 추출 키트를 사용하여 정제한다. 충분한 로그 단계 또는 초기 정지 단계 promastigotes가 될 때까지 기생충 배양을 성장시킵니다.
필요한 경우 여러 배양 플라스크의 내용물을 풀링합니다. 기생충 배양액을 실온에서 3분 동안 2, 000 G에서 원심분리한다. 펠릿을 섭씨 4도의 전기천공 완충액에 재현탁하여 밀리리터당 10에서 8번째 기생충의 1배 농도를 얻고 10분 동안 얼음 위에 유지합니다.
동시에, 50 마이크로리터의 물 또는 pH 8.0의 10 밀리몰 트리스 완충액과 2 밀리미터 직경의 전기천공 큐벳에 2 내지 10 마이크로그램의 선형화된 pLEXSY eGFP 구조가 있는 프리콜 튜브. 다음으로, 선형화된 플라스미드가 있는 튜브에 350마이크로리터의 미리 냉각된 기생충을 추가하고 전체 400마이크로리터를 얼음 위의 전기천공 큐벳으로 옮깁니다. 플라스미드로 기생충 세포를 전기천공하고 플라스미드 DNA가 없는 기생충 세포를 음성 대조군으로 병렬로 전기천공합니다.
큐벳을 얼음 위에 10 분 동안 올려 놓으십시오. 전기천공된 기생충을 적절한 배양액 5밀리리터로 옮기고 섭씨 26도에서 20시간 동안 배양합니다. 전기천공 후 약 20시간 후에 현미경으로 배양을 관찰하고 사용된 pLEXSY 플라스미드에 따라 적절한 선택적 항생제를 추가합니다.
플라스미드 DNA가 있는 기생충과 없는 기생충 사이에 명확한 차이가 있을 때까지 배양을 현미경으로 추적합니다. 유세포 분석을 통해 기생충 형광을 확인하기 위해, 고정상 배양액 1 밀리리터를 2, 000 G에서 실온에서 3 분 동안 원심 분리한다. 세포를 PBS로 2회 세척한 후, 최종 펠릿을 PBS 1밀리리터에 재현탁시킨다.
샘플을 실행하고 초당 0.5 마이크로 리터의 속도로 20, 000 개의 이벤트를 수집합니다. 순방향 산란, 측면 산란 및 형광 1 채널의 게인 값을 각각 225.0, 200.0 및 520.0으로 설정합니다. 기생충 개체군을 포함하는 게이트 G1을 만듭니다.
해당 게이트를 통해 FL1 채널을 필터링하여 프로마스티고트의 자가형광을 결정하고 FL1 채널에 대한 범위 게이트 G2를 설정합니다. transfection 된 기생충을 실행하여 형광이 있는지 확인하십시오. G1에서 형광 기생충의 백분율과 G2의 형광 강도 평균을 기록합니다. 고정상 기생충 배양액의 2 내지 5 밀리리터에서 기존의 페놀 클로로포름 추출 또는 상용 키트를 사용하여 게놈 DNA를 정제합니다.
원고에 설명된 대로 사이클링 프로토콜을 사용하여 pLEXSY-sat2.1에 대한 진단 PCR을 수행합니다. 유세포 분석을 통해 형광을 확인한 후, 밀리리터 당 5 개의 promastigotes의 농도로 재조합 기생충의 희석액을 준비하십시오. 이 희석액 100마이크로리터를 96웰 플레이트의 각 웰에 추가하고 플레이트를 최소 12시간 동안 방해받지 않고 그대로 둡니다.
기생충 성장이 있는 우물이 감지될 때까지 최소 100X 배율로 판을 현미경으로 관찰합니다. 우물이 기생충으로 가득 차면 내용물을 사용하여 5 밀리리터 배양 물을 접종하십시오. 클론 시드 배양이 정지 단계에 도달하면 앞서 설명한 대로 유세포 분석을 사용하여 형광을 확인합니다.
98%에서 99%의 형광 기생충과 in vitro 및 in vivo 분석에서 가장 높은 평균 형광 강도를 가진 클론을 선택하십시오. pLEXSY eGFP 구축물로 형질전환된 대장균 세포의 콜로니 PCR은 859 염기쌍 생성물을 생성하였다. SWA1을 사용한 플라스미드의 전체 소화는 E.coli에서 복제 및 선택에 필요한 모든 요소를 포함하는 2.9 킬로염기쌍 단편과 형질감염에 사용되는 선형화된 발현 카세트를 나타내는 7 내지 8킬로염기쌍 단편의 2개의 단편을 생성했습니다.
유세포 분석 결과 형질감염된 L.panamensis 기생충의 82%가 eGFP를 발현하는 것으로 나타났습니다. 다클론 선별 후, 유세포 분석으로 분석한 L.donovani 기생충의 98.44%가 L.panamensis의 82.0%와 비교하여 형광을 발했습니다. pLEXSY eGFP를 SSU 유전자좌에 성공적으로 통합한 결과 진단 PCR에서 2.3킬로베이스 쌍 산물이 생성되었습니다.
형광 기생충의 비율이 가장 높고 평균 형광 강도를 갖는 클론을 약물 스크리닝 분석에 추가로 사용하기 위해 선택했습니다. 이 방법을 사용하면 재조합 리슈만편모충 기생충을 생산할 수 있습니다.
