Этот протокол является ключевым для создания штаммов, которые могут быть использованы в высокопроизводительных скрининговых анализах для оценки потенциала и традиционной активности молекул Демонстрировать процедуру будут Хуана Кинтеро и Лаура Пинеда, научные сотрудники моей лаборатории. Для начала амплифицируйте ген-мишень с помощью полимеразы высокой точности, чтобы сохранить кодирующую последовательность. Добавьте праймеры в реакционную смесь в конечной концентрации 0,2 микромоляра и запустите протокол циклирования ПЦР, как описано в рукописи.
Очистите амплифицированный фрагмент ПЦР с помощью обычного набора для очистки продукта ПЦР. Чтобы обрезать концы продукта ПЦР eGFP, наладьте реакцию с ферментом Kpn I в соответствии с инструкцией производителя и инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия в течение одного часа. Затем добавляют в реакцию 100 миллимоляров хлорида натрия и 10 единиц Bgl II и инкубируют в течение 15 минут.
После переваривания очистите реакцию, как показано ранее. Затем расщепляем вектор экспрессии pLEXSY с Bgl II и Kpl I после последовательного расщепления, как было показано ранее. Лигируют 100 нанограммов переваренного вектора pLEXSY и 28 нанограммов переваренного eGFP в реакции объемом 20 микролитров, содержащей буфер лигазы и три единицы ДНК-лигазы T4.
Инкубируйте в течение ночи при температуре четыре градуса по Цельсию. В конце инкубации трансформируют компетентные клетки Escherichia coli продуктом лигирования, используя стандартные протоколы трансформации. Поместите трансформированные клетки в ампициллиновый агар LB и инкубируйте в течение 24 часов при температуре 30 градусов Цельсия для отбора рекомбинантных клонов.
После скрининга колоний очистите плазмидную ДНК от положительного клона для последующей трансфекции с помощью коммерческого набора для выделения плазмид. Для получения линеаризованных фрагментов плазмиды берут не менее 10 мкг очищенной плазмиды pLEXSY eGFP и расщепляют ее с SWA1 в течение трех-четырех часов при температуре 25 градусов Цельсия. По окончании инкубации нагрейте продукт сбраживания при температуре 65 градусов Цельсия в течение 20 минут.
Затем запустить продукт пищеварения в электрофорезе агарозного геля для разделения полученных фрагментов. Очистите кассету для сцеживания с помощью коммерческого набора для экстракции агарозного геля в соответствии с инструкциями производителя. Выращивайте культуры паразитов до тех пор, пока не появится достаточное количество промастигот, находящихся в логарифмической фазе или в ранней стационарной фазе.
При необходимости объедините содержимое нескольких колб с культурой. Центрифугируют культуру паразитов при 2 000 Г в течение трех минут при комнатной температуре. Повторно суспендируйте гранулу в электропорационном буфере при температуре четыре градуса Цельсия до концентрации от 10 до 8 паразитов на миллилитр и держите на льду 10 минут.
В то же время предварительно охлаждаемые пробирки с 2-10 мкг линеаризованного pLEXSY eGFP конструируют в 50 микролитрах воды или 10-миллимолярном трис-буфере с рН 8,0 и электропорационными кюветами диаметром два миллиметра. Далее в пробирку с линеаризованной плазмидой добавляют 350 микролитров предварительно охлажденных паразитов и переносят все 400 микролитров в электропорационную кювету на льду. Электропорация клеток паразита с плазмидой и параллельно клеток паразитов без плазмидной ДНК в качестве отрицательного контроля.
Поставьте кювету на лед на 10 минут. Перенесите электропорированных паразитов в пять миллилитров соответствующей питательной среды и инкубируйте при температуре 26 градусов Цельсия в течение 20 часов. Примерно через 20 часов после электропорации наблюдайте за культурами под микроскопом и добавляйте соответствующий селективный антибиотик в зависимости от используемой плазмиды pLEXSY.
Следите за посевами под микроскопом до тех пор, пока не появится четкая разница между паразитами, электропорированными с плазмидной ДНК и без нее. Для проверки флуоресценции паразитов методом проточной цитометрии центрифугируют один миллилитр культуры неподвижной фазы при 2 000 G в течение трех минут при комнатной температуре. После двойной промывки клеток в PBS повторно суспендируйте конечную гранулу в одном миллилитре PBS.
Запустите выборки и соберите 20 000 событий со скоростью 0,5 микролитра в секунду. Установите значения усиления для каналов прямого рассеяния, бокового рассеяния и флуоресценции равные 225,0, 200,0 и 520,0 соответственно. Создайте вентиль G1, содержащий популяцию паразитов.
Отфильтруйте канал FL1 через этот вентиль, чтобы определить автофлуоресценцию промастигот, и установите вентиль диапазона G2 для канала FL1. Запустите трансфицированных паразитов, чтобы проверить, есть ли флуоресценция. Запишите процент флуоресцентных паразитов в G1 и среднюю интенсивность флуоресценции в G2. Очистите геномную ДНК от двух до пяти миллилитров культуры паразитов в стационарной фазе с помощью обычной экстракции фенолхлороформом или с помощью коммерческого набора.
Провести диагностическую ПЦР для pLEXSY-sat2.1 с использованием циклического протокола, как описано в рукописи. После подтверждения флуоресценции с помощью проточной цитометрии готовят разведение рекомбинантных паразитов в концентрации пять промастигот на миллилитр. Добавьте 100 микролитров этого разведения в каждую лунку 96-луночной планшета и оставьте планшет нетронутым не менее чем на 12 часов.
Следите за пластиной под микроскопом при минимальном увеличении 100X до тех пор, пока не будут обнаружены лунки с ростом паразитов. Когда лунка наполнена паразитами, используйте содержимое для инокуляции пятимиллилитровой культуры. После того, как клонированные посевные культуры достигнут стационарной фазы, проверьте флуоресценцию с помощью проточной цитометрии, как описано выше.
Выберите клоны с 98-99% флуоресцентных паразитов и самой высокой средней интенсивностью флуоресценции для анализов in vitro и in vivo. Методом ПЦР колоний клеток E.coli, трансформированных с помощью конструкции pLEXSY eGFP, был получен продукт из 859 пар оснований. В результате полного расщепления плазмиды с помощью SWA1 были получены два фрагмента: фрагмент парой 2,9 килооснований, содержащий все необходимые элементы для репликации и отбора в E.coli, и фрагмент из 7-8 пар килооснований, представляющий собой линеаризованную экспрессионную кассету, используемую для трансфекции.
Анализ методом проточной цитометрии показал, что 82% трансфицированных паразитов L. panamensis экспрессировали рГФП. После поликлональной селекции 98,44% паразитов L.donovani, проанализированных методом проточной цитометрии, были флуоресцентными по сравнению с 82,0% L.panamensis. Успешная интеграция pLEXSY eGFP в локус SSU привела к получению 2,3 килобазного парного продукта в диагностической ПЦР.
Для дальнейшего использования в скрининговых анализах лекарственных препаратов были отобраны клоны с наибольшим процентом флуоресцентных паразитов и средней интенсивностью флуоресценции. Этот метод позволяет производить рекомбинантных паразитов Leishmania с помощью
