Este protocolo é fundamental para gerar cepas que podem ser usadas em ensaios de triagem de alto rendimento para avaliar o potencial e a atividade tradicional de moléculas Demonstrando o procedimento estarão Juana Quintero e Laura Pineda, assistentes de pesquisa do meu laboratório. Para começar, amplie o gene alvo usando uma polimerase de alta fidelidade para preservar a sequência codificante. Adicionar os primers à mistura de reação em uma concentração final de 0,2 micromolar e executar um protocolo de ciclagem de PCR conforme descrito no manuscrito.
Purificar o fragmento de PCR amplificado usando um kit de purificação de produto PCR convencional. Para cortar as extremidades do produto de PCR eGFP, configure uma reação com a enzima Kpn I de acordo com as instruções do fabricante e incube a 37 graus Celsius por uma hora. Em seguida, adicione 100 milimolares de cloreto de sódio e 10 unidades de Bgl II à reação e incube por 15 minutos.
Após a digestão, purifice a reação como mostrado anteriormente. Em seguida, digerir o vetor de expressão pLEXSY com Bgl II e Kpl I após a digestão sequencial, como demonstrado anteriormente. Ligate 100 nanogramas de vetor pLEXSY digerido e 28 nanogramas de eGFP digerido em uma reação de 20 microlitros contendo tampão ligase e três unidades de T4 DNA ligase.
Incubar durante a noite a quatro graus Celsius. Ao final da incubação, transformar células competentes de Escherichia coli com o produto da ligadura utilizando protocolos de transformação padrão. Plaquear as células transformadas em ágar ampicilina LB e incubar por 24 horas a 30 graus Celsius para selecionar clones recombinantes.
Após a triagem das colônias, purificar o DNA plasmidial de um clone positivo para posterior transfecção usando um kit comercial de isolamento de plasmídeos. Para produzir fragmentos linearizados do plasmídeo, tome pelo menos 10 microgramas do plasmídeo purificado pLEXSY eGFP e digere-o com SWA1 por três a quatro horas a 25 graus Celsius. No final da incubação, o calor inativa o produto da digestão a 65 graus Celsius por 20 minutos.
Em seguida, execute o produto da digestão em eletroforese em gel de agarose para separar os fragmentos resultantes. Purificar o de expressão usando um kit comercial de extração em gel de agarose de acordo com as instruções do fabricante. Cultivar as culturas do parasita até que haja promastigotas suficientes na fase logarítmica ou no início da fase estacionária.
Agrupe o conteúdo de vários frascos de cultura, se necessário. Centrifugar a cultura do parasita a 2.000 G durante três minutos à temperatura ambiente. Ressuspenda o pellet em tampão de eletroporação a quatro graus Celsius para obter uma concentração de uma vez 10 a oitavo parasitas por mililitro e mantenha-o no gelo por 10 minutos.
Simultaneamente, tubos de pré-resfriamento com 2 a 10 microgramas de pLEXSY linearizado eGFP são construídos em 50 microlitros de água ou tampão tris 10 milimolares com pH 8,0 e cubetas de eletroporação de dois milímetros de diâmetro. Em seguida, adicione 350 microlitros de parasitas pré-resfriados ao tubo com o plasmídeo linearizado e transfira os 400 microlitros inteiros para a cubeta de eletroporação no gelo. Eletroporar as células do parasita com plasmídeo e, em paralelo, células do parasita sem DNA plasmidial como controle negativo.
Coloque a cubeta no gelo por 10 minutos. Transferir os parasitas eletroporados para cinco mililitros do meio de cultura apropriado e incubar a 26 graus Celsius por 20 horas. Aproximadamente 20 horas após a eletroporação, observar as culturas ao microscópio e adicionar o antibiótico seletivo apropriado, dependendo do plasmídeo pLEXSY utilizado.
Seguir microscopicamente as culturas até que haja uma clara diferença entre parasitas eletroporados com e sem DNA plasmidial. Para verificar a fluorescência do parasito por citometria de fluxo, centrifugar um mililitro da cultura em fase estacionária a 2.000 G por três minutos à temperatura ambiente. Depois de lavar as células duas vezes em PBS, ressuspenda o pellet final em um mililitro de PBS.
Execute amostras e colete 20.000 eventos a uma velocidade de 0,5 microlitros por segundo. Defina os valores de ganho para os canais de dispersão direta, dispersão lateral e fluorescência como 225,0, 200,0 e 520,0, respectivamente. Crie um portão G1 contendo a população de parasitas.
Filtre o canal FL1 através dessa porta para determinar a autofluorescência das promastigotas e defina uma porta de alcance G2 para o canal FL1. Execute os parasitas transfectados para verificar se há fluorescência. Registrar a porcentagem de parasitos fluorescentes no G1 e a média da intensidade da fluorescência no G2. Purificar o DNA genômico de dois a cinco mililitros de uma cultura de parasita em fase estacionária por extração convencional de clorofórmio fenólico ou com um kit comercial.
Realizar PCR diagnóstico para pLEXSY-sat2.1 usando um protocolo de ciclagem conforme descrito no manuscrito. Após a confirmação da fluorescência por citometria de fluxo, preparar uma diluição de parasitas recombinantes na concentração de cinco promastigotas por mililitro. Adicione 100 microlitros desta diluição em cada poço de uma placa de 96 poços e deixe a placa intacta por pelo menos 12 horas.
Seguir a placa microscopicamente em um aumento mínimo de 100X até que poços com crescimento parasitário sejam detectados. Quando um poço estiver cheio de parasitas, use o conteúdo para inocular uma cultura de cinco mililitros. Uma vez que as culturas das sementes clonais atinjam a fase estacionária, verifique a fluorescência por citometria de fluxo, como descrito anteriormente.
Selecionar clones com 98% a 99% de parasitas fluorescentes e a maior intensidade média de fluorescência para ensaios in vitro e in vivo. A PCR de colônia das células de E.coli transformadas com a construção eGFP pLEXSY gerou um produto de 859 pares de bases. A digestão total do plasmídeo usando SWA1 resultou em dois fragmentos, um fragmento de par de 2,9 quilobases contendo todos os elementos necessários para replicação e seleção em E.coli e um fragmento de par de sete a oito quilobases representando o de expressão linearizado que é usado para transfecção.
A análise por citometria de fluxo revelou que 82% dos parasitas transfectados de L. panamensis expressaram eGFP. Após seleção policlonal, 98,44% dos parasitos de L.donovani analisados por citometria de fluxo foram fluorescentes em comparação com 82,0% de L.panamensis. A integração bem-sucedida da eGFP pLEXSY no locus SSU resultou em um produto de par de 2,3 quilobases na PCR diagnóstica.
Clones com a maior porcentagem de parasitas fluorescentes e intensidade média de fluorescência foram selecionados para uso posterior em ensaios de triagem de drogas. Este método permite a produção de parasitas recombinantes de Leishmania com o
