Ce protocole est essentiel pour générer des souches qui peuvent être utilisées dans des tests de criblage à haut débit afin d’évaluer le potentiel et l’activité traditionnelle des molécules. Juana Quintero et Laura Pineda, assistantes de recherche de mon laboratoire, feront la démonstration de la procédure. Pour commencer, amplifiez le gène cible à l’aide d’une polymérase haute fidélité pour préserver la séquence codante. Ajouter les amorces au mélange réactionnel à une concentration finale de 0,2 micromolaire et exécuter un protocole de cycle PCR tel que décrit dans le manuscrit.
Purifiez le fragment de PCR amplifié à l’aide d’un kit de purification de produit PCR conventionnel. Pour couper les extrémités du produit eGFP PCR, mettre en place une réaction avec l’enzyme Kpn I selon les instructions du fabricant et incuber à 37 degrés Celsius pendant une heure. Ajouter ensuite 100 millimolaires de chlorure de sodium et 10 unités de Bgl II à la réaction et incuber pendant 15 minutes.
Après la digestion, purifiez la réaction comme indiqué précédemment. Ensuite, digérer le vecteur d’expression pLEXSY avec Bgl II et Kpl I après la digestion séquentielle comme démontré précédemment. Ligate 100 nanogrammes de vecteur pLEXSY digéré et 28 nanogrammes d’eGFP digéré dans une réaction de 20 microlitres contenant un tampon ligase et trois unités d’ADN ligase T4.
Incuber pendant la nuit à quatre degrés Celsius. À la fin de l’incubation, transformer les cellules compétentes d’Escherichia coli avec le produit de ligature en utilisant des protocoles de transformation standard. Plaquer les cellules transformées dans de la gélose à l’ampicilline LB et incuber pendant 24 heures à 30 degrés Celsius pour sélectionner des clones recombinants.
Après avoir examiné les colonies, purifier l’ADN plasmidique d’un clone positif pour une transfection ultérieure à l’aide d’un kit d’isolement plasmidique commercial. Pour produire des fragments linéarisés du plasmide, prenez au moins 10 microgrammes du plasmide pLEXSY eGFP purifié et digérez-le avec SWA1 pendant trois à quatre heures à 25 degrés Celsius. À la fin de l’incubation, la chaleur inactive le produit de digestion à 65 degrés Celsius pendant 20 minutes.
Ensuite, exécutez le produit de digestion dans une électrophorèse sur gel d’agarose pour séparer les fragments obtenus. Purifier la cassette d’expression à l’aide d’une trousse commerciale d’extraction de gel d’agarose conformément aux instructions du fabricant. Cultiver les cultures de parasites jusqu’à ce qu’il y ait suffisamment de promastigotes en phase logarithmique ou en phase stationnaire précoce.
Mettez en commun le contenu de plusieurs flacons de culture si nécessaire. Centrifuger la culture parasitaire à 2 000 G pendant trois minutes à température ambiante. Remettez la pastille en suspension dans un tampon d’électroporation à quatre degrés Celsius pour obtenir une concentration d’une fois 10 à huit parasites par millilitre et gardez-la sur la glace pendant 10 minutes.
Simultanément, des tubes de pré-refroidissement avec 2 à 10 microgrammes de pLEXSY eGFP linéarisé construisent dans 50 microlitres d’eau ou un tampon tris millimolaire de 10 millimolaires avec pH 8,0 et des cuvettes d’électroporation de deux millimètres de diamètre. Ensuite, ajoutez 350 microlitres de parasites pré-refroidis dans le tube avec le plasmide linéarisé et transférez la totalité des 400 microlitres dans la cuvette d’électroporation sur glace. Électroporate les cellules parasitaires avec plasmide et en parallèle, les cellules parasitaires sans ADN plasmidique comme contrôle négatif.
Mettez la cuvette sur la glace pendant 10 minutes. Transférer les parasites électroporés dans cinq millilitres du milieu de culture approprié et incuber à 26 degrés Celsius pendant 20 heures. Environ 20 heures après l’électroporation, observer les cultures au microscope et ajouter l’antibiotique sélectif approprié en fonction du plasmide pLEXSY utilisé.
Suivez les cultures au microscope jusqu’à ce qu’il y ait une différence claire entre les parasites électroporés avec et sans ADN plasmidique. Pour vérifier la fluorescence du parasite par cytométrie en flux, centrifuger un millilitre de la culture en phase stationnaire à 2 000 g pendant trois minutes à température ambiante. Après avoir lavé les cellules deux fois dans du PBS, remettre en suspension la pastille finale dans un millilitre de PBS.
Exécutez des échantillons et collectez 20 000 événements à une vitesse de 0,5 microlitre par seconde. Définissez les valeurs de gain pour les canaux de diffusion directe, de diffusion latérale et de fluorescence un sur 225,0, 200,0 et 520,0 respectivement. Créez une porte G1 contenant la population parasitaire.
Filtrez le canal FL1 à travers cette porte pour déterminer l’autofluorescence des promastigotes et définissez une porte de plage G2 pour le canal FL1. Exécutez les parasites transfectés pour vérifier s’il y a fluorescence. Notez le pourcentage de parasites fluorescents dans G1 et la moyenne de l’intensité de fluorescence dans G2. Purifier l’ADN génomique de deux à cinq millilitres d’une culture parasitaire en phase stationnaire par extraction conventionnelle de phénol chloroforme ou avec un kit commercial.
Effectuer une PCR diagnostique pour pLEXSY-sat2.1 à l’aide d’un protocole de cycle tel que décrit dans le manuscrit. Après confirmation de la fluorescence par cytométrie en flux, préparer une dilution de parasites recombinants à une concentration de cinq promastigotes par millilitre. Ajouter 100 microlitres de cette dilution dans chaque puits d’une plaque de 96 puits et laisser la plaque intacte pendant au moins 12 heures.
Suivez la plaque au microscope à un grossissement minimum de 100X jusqu’à ce que des puits avec une croissance parasitaire soient détectés. Lorsqu’un puits est plein de parasites, utilisez le contenu pour inoculer une culture de cinq millilitres. Une fois que les cultures ensemencées par clonage atteignent la phase stationnaire, vérifier la fluorescence à l’aide de la cytométrie de flux décrite précédemment.
Sélectionner des clones contenant 98 % à 99 % de parasites fluorescents et l’intensité de fluorescence moyenne la plus élevée pour les essais in vitro et in vivo. La PCR des colonies de cellules E. coli transformées avec la construction pLEXSY eGFP a généré un produit de 859 paires de bases. La digestion totale du plasmide à l’aide de SWA1 a donné deux fragments, un fragment de paires de 2,9 kilobases contenant tous les éléments nécessaires à la réplication et à la sélection chez E. coli et un fragment de paires de sept à huit kilobases représentant la cassette d’expression linéarisée utilisée pour la transfection.
L’analyse par cytométrie de flux a révélé que 82 % des parasites L. panamensis transfectés exprimaient une eGFP. Après sélection polyclonale, 98,44% des parasites L.donovani analysés par cytométrie de flux étaient fluorescents contre 82,0% des L. panamensis. L’intégration réussie de pLEXSY eGFP dans le locus SSU a abouti à un produit de paire de 2,3 kilobases dans la PCR diagnostique.
Les clones présentant le pourcentage le plus élevé de parasites fluorescents et l’intensité moyenne de fluorescence ont été sélectionnés pour une utilisation ultérieure dans les tests de dépistage de médicaments. Cette méthode permet la production de parasites Leishmania recombinants avec le
