Dieses Protokoll ist der Schlüssel zur Generierung von Stämmen, die in Hochdurchsatz-Screening-Assays verwendet werden können, um das Potenzial und die traditionelle Aktivität von Molekülen zu bewerten. Amplifizieren Sie zunächst das Zielgen mit einer High-Fidelity-Polymerase, um die kodierende Sequenz zu erhalten. Geben Sie die Primer in einer Endkonzentration von 0,2 Mikromolar in die Reaktionsmischung und führen Sie ein PCR-Zyklusprotokoll durch, wie im Manuskript beschrieben.
Reinigen Sie das amplifizierte PCR-Fragment mit einem herkömmlichen PCR-Produktreinigungskit. Um die Enden des eGFP-PCR-Produkts abzuschneiden, wird eine Reaktion mit dem Enzym Kpn I gemäß den Anweisungen des Herstellers eingeleitet und eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius inkubiert. Dann werden 100 Millimolar Natriumchlorid und 10 Einheiten Bgl II zur Reaktion gegeben und 15 Minuten inkubiert.
Nach der Verdauung reinigen Sie die Reaktion wie zuvor gezeigt. Als nächstes wird der pLEXSY-Expressionsvektor mit Bgl II und Kpl I nach dem sequenziellen Verdau verdaut, wie zuvor gezeigt. Ligatieren Sie 100 Nanogramm des verdauten pLEXSY-Vektors und 28 Nanogramm des verdauten eGFP in einer 20-Mikroliter-Reaktion, die Ligasepuffer und drei Einheiten T4-DNA-Ligase enthält.
Über Nacht bei vier Grad Celsius inkubieren. Am Ende der Inkubation werden kompetente Escherichia coli-Zellen mit dem Ligationsprodukt unter Verwendung von Standard-Transformationsprotokollen transformiert. Die transformierten Zellen werden in LB-Ampicillin-Agar plattiert und 24 Stunden lang bei 30 Grad Celsius inkubiert, um rekombinante Klone auszuwählen.
Nach dem Screening der Kolonien wird die Plasmid-DNA eines positiven Klons für die anschließende Transfektion mit einem kommerziellen Plasmid-Isolationskit gereinigt. Um linearisierte Fragmente des Plasmids herzustellen, nehmen Sie mindestens 10 Mikrogramm des gereinigten pLEXSY eGFP-Plasmids und verdauen es mit SWA1 für drei bis vier Stunden bei 25 Grad Celsius. Am Ende der Inkubation wird das Verdauungsprodukt bei 65 Grad Celsius für 20 Minuten durch Hitze inaktiviert.
Anschließend wird das Aufschlussprodukt in Agarose-Gelelektrophorese ausgeführt, um die resultierenden Fragmente zu trennen. Reinigen Sie die Expressionskassette mit einem handelsüblichen Agarose-Gel-Extraktionskit gemäß den Anweisungen des Herstellers. Züchten Sie die Parasitenkulturen, bis genügend Promastigoten in der Log-Phase oder in der frühen stationären Phase vorhanden sind.
Fassen Sie bei Bedarf den Inhalt mehrerer Kulturflaschen zusammen. Die Parasitenkultur wird bei 2.000 G drei Minuten lang bei Raumtemperatur zentrifugiert. Resuspendieren Sie das Pellet in Elektroporationspuffer bei vier Grad Celsius, um eine Konzentration von eins mal 10 bis zum achten Parasiten pro Milliliter zu erhalten, und lassen Sie es 10 Minuten lang auf Eis.
Gleichzeitig werden Pre-Chill-Röhrchen mit 2 bis 10 Mikrogramm linearisiertem pLEXSY eGFP in 50 Mikroliter Wasser oder 10 Millimolar Tris-Puffer mit pH 8,0 und Elektroporationsküvetten mit zwei Millimetern Durchmesser konstruiert. Als nächstes werden 350 Mikroliter vorgekühlte Parasiten in das Röhrchen mit dem linearisierten Plasmid gegeben und die gesamten 400 Mikroliter auf Eis in die Elektroporationsküvette überführt. Elektropolieren Sie die Parasitenzellen mit Plasmid und parallel dazu Parasitenzellen ohne Plasmid-DNA als Negativkontrolle.
Die Küvette für 10 Minuten auf Eis legen. Die elektroporierten Parasiten werden in fünf Milliliter des entsprechenden Nährmediums überführt und 20 Stunden lang bei 26 Grad Celsius inkubiert. Etwa 20 Stunden nach der Elektroporation werden die Kulturen unter dem Mikroskop beobachtet und je nach verwendetem pLEXSY-Plasmid das entsprechende selektive Antibiotikum zugegeben.
Verfolgen Sie die Kulturen mikroskopisch, bis es einen deutlichen Unterschied zwischen elektroporierten Parasiten mit und ohne Plasmid-DNA gibt. Um die Fluoreszenz der Parasiten durch Durchflusszytometrie zu überprüfen, wird ein Milliliter der stationären Phasenkultur bei 2.000 G drei Minuten lang bei Raumtemperatur zentrifugiert. Nachdem Sie die Zellen zweimal in PBS gewaschen haben, resuspendieren Sie das endgültige Pellet in einem Milliliter PBS.
Führen Sie Proben durch und erfassen Sie 20.000 Ereignisse mit einer Geschwindigkeit von 0,5 Mikrolitern pro Sekunde. Legen Sie die Verstärkungswerte für die Kanäle "Vorwärtsstreuung", "Seitenstreuung" und "Fluoreszenz" auf 225,0, 200,0 bzw. 520,0 fest. Erstellen Sie ein Gatter G1, das die Parasitenpopulation enthält.
Filtern Sie den FL1-Kanal durch dieses Gatter, um die Autofluoreszenz von Promastigoten zu bestimmen, und stellen Sie ein Bereichstor G2 für den FL1-Kanal ein. Führen Sie die transfizierten Parasiten aus, um zu überprüfen, ob Fluoreszenz vorhanden ist. Notieren Sie den Prozentsatz der fluoreszierenden Parasiten in G1 und die mittlere Fluoreszenzintensität in G2. Reinigen Sie genomische DNA aus zwei bis fünf Millilitern einer stationären Phasen-Parasitenkultur durch konventionelle Phenolchloroform-Extraktion oder mit einem kommerziellen Kit.
Führen Sie eine diagnostische PCR für pLEXSY-sat2.1 unter Verwendung eines Zyklusprotokolls durch, wie im Manuskript beschrieben. Nach Bestätigung der Fluoreszenz durch Durchflusszytometrie wird eine Verdünnung rekombinanter Parasiten mit einer Konzentration von fünf Promastigoten pro Milliliter hergestellt. Geben Sie 100 Mikroliter dieser Verdünnung in jede Vertiefung einer 96-Well-Platte und lassen Sie die Platte mindestens 12 Stunden lang ungestört.
Verfolgen Sie die Platte mikroskopisch mit einer minimalen Vergrößerung von 100X, bis Vertiefungen mit Parasitenwachstum entdeckt werden. Wenn ein Brunnen voller Parasiten ist, verwenden Sie den Inhalt, um eine Fünf-Milliliter-Kultur zu impfen. Sobald die geklonten Kulturen die stationäre Phase erreicht haben, überprüfen Sie die Fluoreszenz mit Hilfe der Durchflusszytometrie, wie zuvor beschrieben.
Wählen Sie Klone mit 98 % bis 99 % fluoreszierenden Parasiten und der höchsten mittleren Fluoreszenzintensität für In-vitro- und In-vivo-Assays. Die Kolonie-PCR der E.coli-Zellen, die mit dem pLEXSY eGFP-Konstrukt transformiert wurden, ergab ein 859-Basenpaar-Produkt. Die vollständige Verdauung des Plasmids mit SWA1 ergab zwei Fragmente, ein 2,9-Kilobasenpaar-Fragment, das alle notwendigen Elemente für die Replikation und Selektion in E. coli enthält, und ein Fragment mit sieben bis acht Kilobasenpaaren, das die linearisierte Expressionskassette darstellt, die für die Transfektion verwendet wird.
Die durchflusszytometrische Analyse zeigte, dass 82% der transfizierten L.panamensis-Parasiten eGFP exprimierten. Nach polyklonaler Selektion waren 98,44% der mittels Durchflusszytometrie analysierten L. donovani Parasiten fluoreszierend im Vergleich zu 82,0% der L. panamensis. Die erfolgreiche Integration von pLEXSY eGFP in den SSU-Locus führte zu einem 2,3-Kilobasenpaar-Produkt in der diagnostischen PCR.
Klone mit dem höchsten Anteil an fluoreszierenden Parasiten und mittlerer Fluoreszenzintensität wurden für die weitere Verwendung in Wirkstoff-Screening-Assays ausgewählt. Diese Methode ermöglicht die Herstellung von rekombinanten Leishmania-Parasiten mit dem
