Los peroxisomas llevan a cabo la oxidación beta y son propensos al daño de ROS. Este método permite investigar cómo las células lidian con los peroxisomas estresados por ROS. Este protocolo no solo se utiliza para atacar globalmente todos los peroxisomas dentro de una población celular, sino que también puede permitir la manipulación de los peroxisomas individuales dentro de células individuales.
La generación de ROS asistida por colorante también se puede usar para atacar orgánulos fuera de los peroxisomas para investigar cómo las células lidian con las lesiones de orgánulos. Para comenzar, siembre dos veces 10 a la quinta células SHSY5Y humanas o seis veces 10 a la cuarta células NIH H3T3 de ratón en 840 microlitros de medio de cultivo en placas de cultivo de 35 milímetros con fondo de vidrio con un micropocillo de vidrio de 20 milímetros de diámetro. Cultive las células por debajo del 5% de dióxido de carbono a 37 grados centígrados durante 24 horas.
A continuación, transfecte las células con los plásmidos deseados utilizando un reactivo de transfección o transfección de células SHSY5Y. Diluir plásmidos en 55 microlitros de DMEM/F-12 sin suero y diluir un microlitro de reactivo de transfección en 55 microlitros de DMEM/F-12 sin suero. Combine el ADN diluido con el reactivo diluido.
Mezclar suavemente e incubar durante 30 minutos a temperatura ambiente. Agregue el complejo al micropocillo de 20 milímetros previamente chapado con 100 microlitros de medio de cultivo que contiene células SHSY5Y sin antibióticos. Agite suavemente el plato hacia adelante y hacia atrás.
Realice la transfección de células NIH 3T3 como se demostró antes, pero sustituya el medio sérico reducido en lugar de DMEM / F-12 sin suero por dilución de plásmidos y reactivo de transfección. Después de dos horas de transfección, retire el medio que contiene reactivo de transfección y agregue un mililitro de medio de cultivo fresco. Incubar las células NIH 3T3 o SHSY5Y a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono durante 24 horas.
Para la producción de ROS activadas por luz, a las 24 horas posteriores a la transfección, retire el medio de cultivo y agregue 10 microlitros de 200 nanomolares del ligando HaloTag TMR o 200 nanomolares Janelia Fluor 646 HaloTag en el micropocillo de vidrio de 20 milímetros. Transfiera el plato a una incubadora de 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono y déjelo durante una hora para teñir las células. Después de una hora, retire bien el medio de tinción y agregue un mililitro de medio de cultivo fresco.
Coloque un plato con fondo de vidrio que contenga las células deseadas en un microscopio confocal de escaneo láser equipado con una incubadora de etapa. En el software, haga clic en Ventana de herramientas, elija Ocular y haga clic en el botón DIA para encender la luz transmitida. Vea el plato a través del ocular del microscopio y enfoque las células girando la perilla de enfoque.
Elija LSM y haga clic en el botón Seleccionar detector de tinte. Haga doble clic en los tintes deseados en la ventana emergente para seleccionar la configuración adecuada de láser y filtro para obtener imágenes de las células. Haga clic en Live4x en el panel Live para iniciar un escaneo láser rápido para comenzar a detectar las señales fluorescentes de las células.
Mueva el escenario con el controlador del joystick y localice las células diKillerRed VKSKL o SLP-VKSKL medianas para aplicar tensión ROS en los peroxisomas. Adquirir una imagen de la célula deseada. Haga clic en Ventana de herramientas y elija LSM Stimulation.
Luego haga clic en el botón de elipse y en la ventana Live Image use el mouse para dibujar un ROI de 15 micrómetros de diámetro que contenga los peroxisomas deseados a los que se aplicará la tensión ROS. Para aplicar estrés ROS, use 561 nanómetros para células con el ligando SLP marcado con diKillerRed VKSKL o TMR y use 640 nanómetros para células teñidas con el ligando SLP marcado con Janelia Fluor 646. Seleccione la longitud de onda del láser para aplicar la tensión ROS.
Introduzca el porcentaje de láser deseado y la duración. Para la producción de ROS en los peroxisomas, haga clic en Adquirir y luego en el botón Estimulación para iniciar el escaneo con 561 o 640 nanómetros de luz a través de los ROI durante 30 segundos cada uno. Esta estimulación corresponde a aproximadamente 5% de ajustes de potencia láser para 561 y 640 nanómetros.
Después de 30 segundos de iluminación láser, los peroxisomas dentro de los ROI pierden sus señales diKillerRed VKSKL, TMR o Janelia Fluor 646. Esta pérdida de señal permite distinguir los peroxisomas iluminados y no iluminados dentro de la célula. Para monitorear las células vivas pexófagas, siga la translocación de Stub1, Hsp70, ubiquitina, p62 o LC3B marcados con EGFP en los peroxisomas iluminados o estresados por ROS mediante imágenes de lapso de tiempo utilizando intervalos de 10 minutos entre cuadros.
La iluminación focal conduce a la producción instantánea y localizada de ROS dentro de los peroxisomas individuales, como lo indica el reportero fluorescente roGFP2-VKSKL. La imagen de diKillerRed VKSKL se tomó después de que se realizaron todas las mediciones de roGFP2-VKSKL para indicar la ubicación de los peroxisomas dañados. Los datos también muestran que los peroxisomas no iluminados no se ven afectados, lo que indica la precisión de la metodología.
Esta metodología se utilizó para monitorizar la pexofagia mediada por Stub1. Durante este proceso, Hsp70, Stub1, proteínas ubiquitinadas, adaptadores de autofagia p62 y LC3B aparecen posteriormente en peroxisomas estresados por ROS para impulsar la pexofagia. Usando la misma estrategia, fue posible dañar simultáneamente todos los peroxisomas en una placa de cultivo para la caracterización bioquímica de la pexofagia mediada por Stub1.
Antes de la iluminación LED, la fluorescencia de EGFP-ubiquitina era homogénea en el citoplasma y no colocalizaba con los peroxisomas. Después de nueve horas de iluminación LED, las señales de EGFP-ubiquitina se acumularon en todos los peroxisomas en las células cultivadas en una placa confocal. Usando este protocolo, encontramos que los peroxisomas estresados por ROS se eliminan a través de una vía de degradación dependiente de ubiquitina.
Los peroxisomas estresados por ROS reclutan la ubiquitina E3 ligasa Stub1 para permitir su eliminación por pexofagia.
