Peroxisomen führen Beta-Oxidation durch und sind anfällig für ROS-Schäden. Mit dieser Methode kann untersucht werden, wie Zellen mit ROS-gestressten Peroxisomen umgehen. Dieses Protokoll wird nicht nur verwendet, um alle Peroxisomen innerhalb einer Zellpopulation global anzusprechen, sondern kann auch die Manipulation der einzelnen Peroxisomen innerhalb einzelner Zellen ermöglichen.
Die farbstoffgestützte ROS-Generierung kann auch verwendet werden, um Organellen außerhalb von Peroxisomen anzusprechen, um zu untersuchen, wie Zellen mit Organellenverletzungen umgehen. Zu Beginn werden zwei mal 10 bis fünfte menschliche SHSY5Y-Zellen oder sechs mal 10 bis vierte NIH H3T3-Zellen der Maus in 840 Mikrolitern Nährmedium auf 35-Millimeter-Kulturschalen mit Glasboden und einer Glasmikrovertiefung mit einem Durchmesser von 20 Millimetern ausgesät. Züchten Sie die Zellen 24 Stunden lang unter 5% Kohlendioxid bei 37 Grad Celsius.
Als nächstes transfizieren Sie die Zellen mit den gewünschten Plasmiden mit einem Transfektionsreagenz oder einer SHSY5Y-Zelltransfektion. Verdünnen Sie die Plasmide in 55 Mikrolitern serumfreiem DMEM/F-12 und verdünnen Sie einen Mikroliter Transfektionsreagenz in 55 Mikrolitern serumfreiem DMEM/F-12. Kombinieren Sie die verdünnte DNA mit dem verdünnten Reagenz.
Vorsichtig mischen und 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Geben Sie den Komplex in das 20-Millimeter-Mikroloch, das zuvor mit 100 Mikrolitern Nährmedium beschichtet wurde, das SHSY5Y-Zellen ohne Antibiotika enthält. Schütteln Sie die Schüssel vorsichtig hin und her.
Führen Sie die NIH 3T3-Zelltransfektion wie zuvor gezeigt durch, ersetzen Sie jedoch reduziertes Serummedium anstelle von serumfreiem DMEM/F-12 für die Plasmidverdünnung und das Transfektionsreagenz. Entfernen Sie nach zwei Stunden Transfektion das transfektionsreagenzienhaltige Medium und fügen Sie einen Milliliter frisches Nährmedium hinzu. Inkubieren Sie die NIH 3T3- oder SHSY5Y-Zellen bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid für 24 Stunden.
Für die lichtaktivierte ROS-Produktion entfernen Sie 24 Stunden nach der Transfektion das Nährmedium und geben 10 Mikroliter des 200 nanomolaren HaloTag TMR-Liganden oder 200 nanomolaren Janelia Fluor 646 HaloTag-Liganden auf das 20-Millimeter-Glasmikroloch. Übertragen Sie die Schale in einen Inkubator mit 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid und lassen Sie sie eine Stunde lang stehen, um die Zellen zu färben. Entfernen Sie nach einer Stunde das Färbemedium gründlich und fügen Sie einen Milliliter frisches Nährmedium hinzu.
Stellen Sie eine Schale mit Glasboden und den gewünschten Zellen auf ein konfokales Laser-Scanning-Mikroskop, das mit einem Tischinkubator ausgestattet ist. Klicken Sie in der Software auf Werkzeugfenster, wählen Sie Okular und klicken Sie auf die DIA-Schaltfläche, um das übertragene Licht einzuschalten. Betrachten Sie die Schüssel durch das Mikroskopokular und bringen Sie die Zellen durch Drehen des Fokusknopfes in den Fokus.
Wählen Sie LSM und klicken Sie auf die Schaltfläche Dye Detector Select. Doppelklicken Sie im Pop-up-Fenster auf die gewünschten Farbstoffe, um die entsprechenden Laser- und Filtereinstellungen für die Abbildung der Zellen auszuwählen. Klicken Sie im Live-Panel auf Live4x, um ein schnelles Laserscanning zu starten, um das Screening nach den Fluoreszenzsignalen der Zellen zu starten.
Bewegen Sie den Tisch mit dem Joystick-Controller und lokalisieren Sie die medialen diKillerRed VKSKL- oder SLP-VKSKL-exprimierenden Zellen, um ROS-Stress auf die Peroxisomen auszuüben. Erfassen Sie ein Bild der gewünschten Zelle. Klicken Sie auf Tool-Fenster und wählen Sie LSM-Stimulation.
Klicken Sie dann auf die Schaltfläche Ellipse und zeichnen Sie im Livebild-Fenster mit der Maus einen ROI von 15 Mikrometern Durchmesser, der die gewünschten Peroxisomen enthält, auf die ROS-Spannung angewendet wird. Um ROS-Stress auszuüben, verwenden Sie 561 Nanometer für Zellen mit dem diKillerRed VKSKL- oder TMR-markierten SLP-Liganden und 640 Nanometer für Zellen, die mit dem Janelia Fluor 646-markierten SLP-Liganden gefärbt sind. Wählen Sie die Laserwellenlänge für die Aufbringung der ROS-Spannung.
Geben Sie den gewünschten Laserprozentsatz und die Dauer ein. Für die ROS-Produktion in den Peroxisomen klicken Sie auf Erfassen und dann auf die Schaltfläche Stimulation, um die Abtastung mit 561 oder 640 Nanometern Licht durch die ROIs für jeweils 30 Sekunden zu starten. Diese Stimulation entspricht ca. 5% Laserleistungseinstellungen für 561 und 640 Nanometer.
Nach 30 Sekunden Laserbeleuchtung verlieren Peroxisomen innerhalb der ROIs ihre diKillerRed VKSKL-, TMR- oder Janelia Fluor 646-Signale. Dieser Signalverlust ermöglicht die Unterscheidung zwischen beleuchteten und unbeleuchteten Peroxisomen innerhalb der Zelle. Um die lebenden Zellen der Pexophagen zu überwachen, verfolgen Sie die Translokation von EGFP-markierten Stub1, Hsp70, Ubiquitin, p62 oder LC3B auf die beleuchteten oder ROS-gestressten Peroxisomen durch Zeitrafferaufnahmen in 10-Minuten-Intervallen zwischen den Bildern.
Fokale Beleuchtung führt zu einer sofortigen und lokalisierten ROS-Produktion innerhalb einzelner Peroxisomen, wie der Fluoreszenzreporter roGFP2-VKSKL zeigt. Das diKillerRed VKSKL-Bild wurde aufgenommen, nachdem alle roGFP2-VKSKL-Messungen durchgeführt wurden, um die Position der beschädigten Peroxisomen anzuzeigen. Die Daten zeigen auch, dass unbeleuchtete Peroxisomen nicht betroffen sind, was auf die Präzision der Methodik hinweist.
Diese Methodik wurde verwendet, um die Stub1-vermittelte Pexophagie zu überwachen. Während dieses Prozesses treten Hsp70, Stub1, ubiquitinierte Proteine, Autophagie-Adapter p62 und LC3B in ROS-gestressten Peroxisomen auf, um die Pexophagie anzutreiben. Mit der gleichen Strategie war es möglich, alle Peroxisomen auf einer Kulturschale gleichzeitig zu schädigen, um die Stub1-vermittelte Pexophagie biochemisch zu charakterisieren.
Vor der LED-Beleuchtung war die EGFP-Ubiquitin-Fluoreszenz im Zytoplasma homogen und kolokalisierte nicht mit den Peroxisomen. Nach neun Stunden LED-Beleuchtung akkumulierten sich die EGFP-Ubiquitin-Signale auf allen Peroxisomen in den Zellen, die in einer konfokalen Schale gezüchtet wurden. Mit Hilfe dieses Protokolls fanden wir heraus, dass ROS-gestresste Peroxisomen über einen Ubiquitin-abhängigen Abbauweg entfernt werden.
ROS-gestresste Peroxisomen rekrutieren die Ubiquitin-E3-Ligase Stub1, um sie durch Pexophagie entfernen zu können.
