I perossisomi effettuano la beta ossidazione e sono soggetti a danni da ROS. Questo metodo permette di studiare come le cellule trattano i perossisomi stressati da ROS. Questo protocollo non viene utilizzato solo per colpire globalmente tutti i perossisomi all'interno di una popolazione cellulare, ma può anche consentire la manipolazione dei singoli perossisomi all'interno di singole cellule.
La generazione di ROS assistita da coloranti può anche essere utilizzata per colpire gli organelli al di fuori dei perossisomi per sondare come le cellule affrontano le lesioni da organello. Per iniziare, seminare due volte 10 alla quinta cellula umana SHSY5Y o sei volte 10 alla quarta cellula NIH H3T3 del topo in 840 microlitri di terreno di coltura su piatti di coltura da 35 millimetri con fondo di vetro con un micropozzetto di vetro di 20 millimetri di diametro. Coltiva le cellule sotto il 5% di anidride carbonica a 37 gradi Celsius per 24 ore.
Quindi, trasfettare le cellule con i plasmidi desiderati usando un reagente di trasfezione o una trasfezione cellulare SHSY5Y. Diluire plasmidi in 55 microlitri di DMEM/F-12 senza siero e diluire un microlitro di reagente di trasfezione in 55 microlitri di DMEM/F-12 senza siero. Combinare il DNA diluito con il reagente diluito.
Mescolare delicatamente e incubare per 30 minuti a temperatura ambiente. Aggiungere il complesso al micropozzetto da 20 millimetri precedentemente placcato con 100 microlitri di terreno di coltura contenente cellule SHSY5Y senza antibiotici. Agitare delicatamente il piatto avanti e indietro.
Eseguire la trasfezione cellulare NIH 3T3 come dimostrato in precedenza, ma sostituire il mezzo sierico ridotto invece di DMEM/F-12 privo di siero per la diluizione del plasmide e il reagente di trasfezione. Dopo due ore di trasfezione, rimuovere il mezzo contenente il reagente di trasfezione e aggiungere un millilitro di terreno di coltura fresco. Incubare le cellule NIH 3T3 o SHSY5Y a 37 gradi Celsius e 5% anidride carbonica per 24 ore.
Per la produzione di ROS attivati dalla luce, a 24 ore dalla trasfezione rimuovere il terreno di coltura e aggiungere 10 microlitri di ligando HaloTag TMR nanomolare o 200 ligando nanomolare Janelia Fluor 646 HaloTag sul micropozzetto di vetro da 20 millimetri. Trasferire il piatto in un incubatore a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica e lasciarlo per un'ora a macchiare le cellule. Dopo un'ora, rimuovere accuratamente il mezzo di colorazione e aggiungere un millilitro di terreno di coltura fresco.
Posizionare un piatto con fondo di vetro contenente le cellule desiderate su un microscopio confocale a scansione laser dotato di un'incubatrice da palcoscenico. Nel software, fare clic su Finestra strumenti, scegliere Ocular e fare clic sul pulsante DIA per accendere la luce trasmessa. Visualizza il piatto attraverso l'oculare del microscopio e metti a fuoco le cellule ruotando la manopola di messa a fuoco.
Scegliere LSM e fare clic sul pulsante Dye Detector Select. Fare doppio clic sui coloranti desiderati nella finestra pop-up per selezionare le impostazioni laser e di filtro appropriate per l'imaging delle cellule. Fare clic su Live4x nel pannello Live per avviare la scansione laser veloce per avviare lo screening dei segnali fluorescenti delle cellule.
Spostare lo stage utilizzando il controller del joystick e individuare le cellule medie che esprimono diKillerRed VKSKL o SLP-VKSKL per applicare lo stress ROS sui perossisomi. Acquisire un'immagine della cella desiderata. Fare clic su Finestra strumento e scegliere Stimolazione LSM.
Quindi fai clic sul pulsante ellisse e nella finestra Live Image usa il mouse per disegnare un ROI di 15 micrometri di diametro contenente i perossisomi desiderati a cui verrà applicata la sollecitazione ROS. Per applicare lo stress ROS, utilizzare 561 nanometri per le cellule con il ligando SLP marcato con diKillerRed VKSKL o TMR e utilizzare 640 nanometri per le cellule colorate con il ligando SLP marcato con Janelia Fluor 646. Selezionare la lunghezza d'onda del laser per applicare la sollecitazione ROS.
Inserisci la percentuale laser desiderata e la durata. Per la produzione di ROS nei perossisomi, fare clic su Acquisisci e quindi sul pulsante Stimolazione per avviare la scansione con 561 o 640 nanometri di luce attraverso i ROI per 30 secondi ciascuno. Questa stimolazione corrisponde a circa il 5% delle impostazioni di potenza del laser per 561 e 640 nanometri.
Dopo 30 secondi di illuminazione laser, i perossisomi all'interno dei ROI perdono i loro segnali diKillerRed VKSKL, TMR o Janelia Fluor 646. Questa perdita di segnale consente di distinguere i perossisomi illuminati e non illuminati all'interno della cellula. Per monitorare le cellule vive dei pexofagei, seguire la traslocazione di Stub1, Hsp70, ubiquitina, p62 o LC3B con tag EGFP sui perossisomi illuminati o sollecitati da ROS mediante imaging time lapse utilizzando intervalli di 10 minuti tra i fotogrammi.
L'illuminazione focale porta alla produzione istantanea e localizzata di ROS all'interno dei singoli perossisomi come indicato dal reporter fluorescente roGFP2-VKSKL. L'immagine diKillerRed VKSKL è stata scattata dopo che tutte le misurazioni roGFP2-VKSKL sono state effettuate per indicare la posizione dei perossisomi danneggiati. I dati mostrano anche che i perossisomi non illuminati non sono interessati, indicando la precisione della metodologia.
Questa metodologia è stata utilizzata per monitorare la esofagia mediata da Stub1. Durante questo processo, Hsp70, Stub1, proteine ubiquitinate, adattatori di autofagia p62 e LC3B appaiono successivamente nei perossisomi stressati da ROS per guidare la pesofagia. Utilizzando la stessa strategia, è stato possibile danneggiare contemporaneamente tutti i perossisomi su un piatto di coltura per la caratterizzazione biochimica della pesofagia mediata da Stub1.
Prima dell'illuminazione a LED, la fluorescenza EGFP-ubiquitina era omogenea nel citoplasma e non colocalizzava con i perossisomi. Dopo nove ore di illuminazione a LED, i segnali EGFP-ubiquitina si sono accumulati su tutti i perossisomi nelle cellule cresciute in un piatto confocale. Utilizzando questo protocollo, abbiamo scoperto che i perossisomi stressati da ROS vengono rimossi attraverso una via di degradazione ubiquitina-dipendente.
I perossisomi stressati da ROS reclutano l'ubiquitina E3 ligasi Stub1 per consentire la loro rimozione mediante pesofagia.
