Пероксисомы осуществляют бета-окисление и склонны к повреждению АФК. Этот метод позволяет исследовать, как клетки справляются с АФК-стрессовыми пероксисомами. Этот протокол используется не только для глобального нацеливания на все пероксисомы в клеточной популяции, но также может позволить манипулировать отдельными пероксисомами в отдельных клетках.
Генерация АФК с помощью красителя также может быть использована для нацеливания на органеллы за пределами пероксисом, чтобы исследовать, как клетки справляются с повреждениями органелл. Для начала засейте два раза по 10 в пятые клетки SHSY5Y человека или шесть раз по 10 в четвертые клетки NIH H3T3 мыши в 840 микролитров питательной среды в 35-миллиметровые чашки для культивирования со стеклянным дном и стеклянную микролунку диаметром 20 миллиметров. Выращивайте клетки при 5% углекислого газа при 37 градусах Цельсия в течение 24 часов.
Затем трансфицируют клетки желаемыми плазмидами с помощью реагента для трансфекции или трансфекции клеток SHSY5Y. Разбавьте плазмиды в 55 микролитрах DMEM/F-12 без сыворотки и разбавьте один микролитр реагента для трансфекции в 55 микролитрах DMEM/F-12 без сыворотки. Соедините разбавленную ДНК с разбавленным реагентом.
Аккуратно перемешайте и выдерживайте 30 минут при комнатной температуре. Добавьте комплекс в 20-миллиметровую микролунку, предварительно покрытую 100 микролитрами питательной среды, содержащей клетки SHSY5Y без антибиотиков. Аккуратно встряхните блюдо вперед и назад.
Выполните трансфекцию клеток NIH 3T3, как показано ранее, но замените восстановленную сывороточную среду вместо безсывороточного DMEM/F-12 для плазмидного разбавления и трансфекционного реагента. Через два часа после трансфекции удалите среду, содержащую реагент для трансфекции, и добавьте один миллилитр свежей питательной среды. Инкубируйте клетки NIH 3T3 или SHSY5Y при 37 градусах Цельсия и 5% углекислого газа в течение 24 часов.
Для получения светоактивируемых АФК через 24 часа после трансфекции удалите питательную среду и добавьте 10 микролитров 200-наномолярного лиганда HaloTag TMR или 200-наномолярного лиганда Janelia Fluor 646 HaloTag на 20-миллиметровую стеклянную микролунку. Перенесите посуду в инкубатор с температурой 37 градусов по Цельсию и 5% углекислого газа и оставьте на один час, чтобы клетки окрасились. Через час тщательно удалите окрашивающую среду и добавьте один миллилитр свежей питательной среды.
Поместите чашку со стеклянным дном, содержащую нужные клетки, на лазерный сканирующий конфокальный микроскоп, оснащенный настольным инкубатором. В программном обеспечении нажмите «Окно инструментов», выберите «Окуляр» и нажмите кнопку DIA, чтобы включить проходящий свет. Посмотрите на тарелку через окуляр микроскопа и сфокусируйте ячейки, повернув ручку фокусировки.
Выберите LSM и нажмите кнопку «Выбор детектора красителей». Дважды щелкните нужные красители во всплывающем окне, чтобы выбрать подходящие настройки лазера и фильтра для визуализации клеток. Нажмите на Live4x на панели Live, чтобы начать быстрое лазерное сканирование, чтобы начать скрининг флуоресцентных сигналов клеток.
Перемещайте сцену с помощью контроллера джойстика и найдите средние клетки, экспрессирующие diKillerRed VKSKL или SLP-VKSKL, чтобы приложить АФК-стресс к пероксисомам. Приобретите изображение нужной ячейки. Нажмите «Окно инструментов» и выберите «Стимуляция LSM».
Затем нажмите кнопку эллипса и в окне Live Image с помощью мыши нарисуйте ROI диаметром 15 микрометров, содержащий желаемые пероксисомы, к которым будет приложено напряжение АФК. Чтобы применить АФК-стресс, используйте 561 нанометр для клеток с лигандом SLP с меченым diKillerRed VKSKL или TMR и используйте 640 нанометров для клеток, окрашенных лигандом SLP, меченным Janelia Fluor 646. Выберите длину волны лазера для приложения напряжения АФК.
Введите желаемый процент лазера и продолжительность. Для производства АФК в пероксисомах нажмите «Получить», а затем кнопку «Стимуляция», чтобы начать сканирование с 561 или 640 нанометрами света через ROI в течение 30 секунд каждый. Эта стимуляция соответствует примерно 5% настройкам мощности лазера для 561 и 640 нанометров.
После 30 секунд лазерной подсветки пероксисомы в ROI теряют свои сигналы diKillerRed VKSKL, TMR или Janelia Fluor 646. Эта потеря сигнала позволяет различать освещенные и неосвещенные пероксисомы внутри клетки. Чтобы контролировать живые клетки пексофагея, следите за транслокацией меченых EGFP Stub1, Hsp70, убиквитин, p62 или LC3B на освещенные или напряженные АФК пероксисомы с помощью покадровой визуализации с использованием 10-минутных интервалов между кадрами.
Фокальное освещение приводит к мгновенному и локализованному образованию АФК в отдельных пероксисомах, на что указывает флуоресцентный репортер roGFP2-VKSKL. Изображение diKillerRed VKSKL было получено после того, как были проведены все измерения roGFP2-VKSKL, чтобы указать местоположение поврежденных пероксиом. Данные также показывают, что неосвещенные пероксисомы не затронуты, что указывает на точность методологии.
Эта методология использовалась для мониторинга пексофагии, опосредованной Stub1. Во время этого процесса Hsp70, Stub1, убиквитинированные белки, адаптеры аутофагии p62 и LC3B впоследствии появляются в АФК-стрессовых пероксисомах, чтобы стимулировать пексофагию. Используя ту же стратегию, можно было одновременно повредить все пероксисомы на чашке для культивирования для биохимической характеристики пексофагии, опосредованной Stub1.
До светодиодного освещения флуоресценция EGFP-убиквитина была однородной в цитоплазме и не локализовалась с пероксисомами. После девяти часов светодиодного освещения сигналы EGFP-убиквитина накапливались на всех пероксисомах в клетках, выращенных в конфокальной чашке. Используя этот протокол, мы обнаружили, что пероксисомы, подвергшиеся стрессу от АФК, удаляются через убиквитин-зависимый путь деградации.
Пероксисомы, стрессированные АФК, рекрутируют убиквитин-E3-лигазу Stub1, чтобы обеспечить их удаление путем пексофагии.
