과산화소체는 베타 산화를 수행하고 ROS 손상을 일으키기 쉽습니다. 이 방법을 사용하면 세포가 ROS 스트레스 과산화소체를 처리하는 방법을 조사할 수 있습니다. 이 프로토콜은 세포 집단 내의 모든 과산화소체를 전역적으로 표적화하는 데 사용될 뿐만 아니라 단일 세포 내에서 개별 과산화소체의 조작을 허용할 수도 있습니다.
염료 보조 ROS 생성은 또한 세포가 세포 소기관 손상을 처리하는 방법을 조사하기 위해 과산화소체 외부의 세포 소기관을 표적으로 삼는 데 사용할 수 있습니다. 시작하기 위해, 2회 10 내지 5번째 인간 SHSY5Y 세포 또는 6회 10 내지 4번째 마우스 NIH H3T3 세포를 20 밀리미터 직경의 유리 마이크로웰을 갖는 유리 바닥 35 밀리미터 배양 접시 상에서 840 마이크로리터의 배양 배지에 시딩한다. 섭씨 37도에서 24 시간 동안 5 % 이산화탄소 아래에서 세포를 성장시킵니다.
다음에, 형질주입 시약 또는 SHSY5Y 세포 형질감염을 사용하여 원하는 플라스미드로 세포를 형질감염시킨다. 플라스미드를 55마이크로리터의 무혈청 DMEM/F-12로 희석하고 1마이크로리터의 트랜스펙션 시약을 55마이크로리터의 무혈청 DMEM/F-12로 희석합니다. 희석 된 DNA를 희석 된 시약과 결합하십시오.
부드럽게 혼합하고 실온에서 30 분 동안 배양하십시오. 항생제 없이 SHSY5Y 세포를 함유하는 배양 배지 100 마이크로리터로 미리 도말한 20-밀리미터 마이크로웰에 복합체를 첨가한다. 접시를 앞뒤로 부드럽게 흔든다.
이전에 입증된 대로 NIH 3T3 세포 형질주입을 수행하되, 플라스미드 희석 및 형질주입 시약을 무혈청 DMEM/F-12 대신 환원된 혈청 배지로 대체합니다. 형질감염 2시간 후, 형질주입 시약 함유 배지를 제거하고, 1밀리리터의 신선한 배양 배지를 첨가한다. NIH 3T3 또는 SHSY5Y 세포를 섭씨 37도 및 5% 이산화탄소에서 24시간 동안 배양합니다.
광-활성화 ROS 생산을 위해, 형질감염 후 24시간에 배양 배지를 제거하고, 200 나노몰 HaloTag TMR 리간드 또는 200 나노몰 Janelia Fluor 646 HaloTag 리간드 10 마이크로리터를 20-밀리미터 유리 마이크로웰 상에 첨가한다. 접시를 섭씨 37도 및 5% 이산화탄소 인큐베이터로 옮기고 1시간 동안 그대로 두어 세포를 염색합니다. 1시간 후, 염색 배지를 완전히 제거하고 신선한 배양 배지 1밀리리터를 첨가한다.
원하는 세포가 들어 있는 유리 바닥 접시를 스테이지 탑 인큐베이터가 장착된 레이저 스캐닝 컨포칼 현미경에 놓습니다. 소프트웨어에서 Tool Window(도구 창)를 클릭하고 Ocular(접안)를 선택한 다음 DIA 버튼을 클릭하여 투과광을 켭니다. 현미경 접안렌즈를 통해 접시를 보고 초점 손잡이를 돌려 세포에 초점을 맞춥니다.
LSM을 선택하고 염료 검출기 선택 버튼을 클릭합니다. 팝업 창에서 원하는 염료를 두 번 클릭하여 세포 이미징에 적합한 레이저 및 필터 설정을 선택합니다. 라이브 패널에서 Live4x를 클릭하면 빠른 레이저 스캔을 시작하여 세포의 형광 신호 스크리닝을 시작할 수 있습니다.
조이스틱 컨트롤러를 사용하여 스테이지를 이동하고 중간 diKillerRed VKSKL 또는 SLP-VKSKL 발현 세포를 찾아 과산화소체에 ROS 스트레스를 가합니다. 원하는 셀의 이미지를 획득합니다. Tool Window(도구 창)를 클릭하고 LSM Stimulation(LSM 자극)을 선택합니다.
그런 다음 타원 버튼을 클릭하고 라이브 이미지 창에서 마우스를 사용하여 ROS 스트레스가 적용될 원하는 과산화소체를 포함하는 직경 15마이크로미터의 ROI를 그립니다. ROS 스트레스를 적용하려면 diKillerRed VKSKL 또는 TMR 표지 SLP 리간드가 있는 세포에는 561 나노미터를 사용하고 Janelia Fluor 646 표지 SLP 리간드로 염색된 세포에는 640 나노미터를 사용합니다. ROS 응력을 가하기 위한 레이저 파장을 선택합니다.
원하는 레이저 백분율과 지속 시간을 입력합니다. 과산화소체에서 ROS를 생성하려면 Acquire(획득)를 클릭한 다음 Stimulation(자극) 버튼을 클릭하여 각각 30초 동안 ROI를 통해 561나노미터 또는 640나노미터의 빛으로 스캔을 시작합니다. 이 자극은 561 및 640 나노미터에 대한 약 5%레이저 출력 설정에 해당합니다.
30초의 레이저 조명 후 ROI 내의 과산화소체는 diKillerRed VKSKL, TMR 또는 Janelia Fluor 646 신호를 잃습니다. 이 신호 손실은 세포 내에서 조명된 과산화소체와 조명되지 않은 과산화소체를 구별할 수 있게 해줍니다. 펙식파데 살아있는 세포를 모니터링하려면 프레임 사이의 10분 간격을 사용하여 타임랩스 이미징을 통해 EGFP 태그 Stub1, Hsp70, 유비퀴틴, p62 또는 LC3B를 조명 또는 ROS 스트레스 과산화소체로 전좌시킵니다.
초점 조명은 형광 리포터 roGFP2-VKSKL에 의해 표시된 대로 개별 과산화소체 내에서 즉각적이고 국부적인 ROS 생성으로 이어집니다. diKillerRed VKSKL 이미지는 손상된 과산화소체의 위치를 나타내기 위해 모든 roGFP2-VKSKL 측정이 수행된 후에 촬영되었습니다. 데이터는 또한 조명되지 않은 과산화소체가 영향을 받지 않는다는 것을 보여주며, 이는 방법론의 정확성을 나타냅니다.
이 방법론은 Stub1 매개 pexophagy를 모니터링하는 데 사용되었습니다. 이 과정에서 Hsp70, Stub1, 유비퀴틴화 단백질, 자가포식 어댑터 p62 및 LC3B가 ROS 스트레스 과산화소체에 연속적으로 나타나 펙소파지를 구동합니다. 동일한 전략을 사용하여 Stub1 매개 pexophagy의 생화학적 특성화를 위해 배양 접시의 모든 과산화소체를 동시에 손상시킬 수 있었습니다.
LED 조명 전에 EGFP-유비퀴틴 형광은 세포질에서 균질했으며 과산화소체와 공동 국소화되지 않았습니다. 9시간 동안 LED 조명을 사용한 후, EGFP-유비퀴틴 신호는 공초점 접시에서 성장한 세포의 모든 과산화소체에 축적되었습니다. 이 프로토콜을 사용하여 ROS 스트레스 과산화소체가 유비퀴틴 의존적 분해 경로를 통해 제거된다는 것을 발견했습니다.
ROS 스트레스 과산화소체는 유비퀴틴 E3 리가제 Stub1을 모집하여 펙소파지에 의한 제거를 허용합니다.
