פרוקסיזומים מבצעים חמצון בטא ומועדים לנזקי ROS. שיטה זו מאפשרת לחקור כיצד תאים מתמודדים עם פרוקסיזומים בסטרס ROS. פרוטוקול זה משמש לא רק כדי להתמקד באופן גלובלי בכל הפרוקסיזומים באוכלוסיית התא, אלא יכול גם לאפשר מניפולציה של הפרוקסיזומים הבודדים בתוך תאים בודדים.
ייצור ROS בסיוע צבע יכול לשמש גם כדי להתמקד באברונים מחוץ לפרוקסיזומים כדי לחקור כיצד תאים מתמודדים עם פציעות אברונים. כדי להתחיל, זרעו פעמיים 10 לתאי SHSY5Y האנושיים החמישיים או שש פעמים 10 לעכבר הרביעי תאי NIH H3T3 ב 840 מיקרוליטר של מדיום תרבית על צלחות תרבית 35 מילימטר עם תחתית זכוכית מיקרווול בקוטר 20 מילימטר. לגדל את התאים תחת 5% פחמן דו חמצני ב 37 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות.
לאחר מכן, transfect את התאים עם פלסמידים הרצויים באמצעות מגיב transfection או SHSY5Y transfection התא. לדלל פלסמידים ב-55 מיקרוליטר של DMEM/F-12 ללא סרום ולדלל מיקרוליטר אחד של מגיב טרנספקציה ב-55 מיקרוליטר של DMEM/F-12 ללא סרום. שלב את ה- DNA המדולל עם מגיב מדולל.
מערבבים בעדינות ודגרים במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. הוסף את הקומפלקס למיקרווול 20 מ"מ מצופה בעבר עם 100 מיקרוליטר של מדיום תרבית המכיל תאי SHSY5Y ללא אנטיביוטיקה. נערו בעדינות את המנה קדימה ואחורה.
בצע טרנספקציה של תאי NIH 3T3 כפי שהודגם קודם לכן, אך החלף את מדיום הסרום המוקטן במקום DMEM/F-12 ללא סרום לדילול פלסמיד ומגיב טרנספקציה. לאחר שעתיים של טרנספקציה, הסר את המדיום המכיל מגיב טרנספקציה והוסף מיליליטר אחד של מדיום תרבית טרי. יש לדגור על תאי NIH 3T3 או SHSY5Y בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו-חמצני למשך 24 שעות.
לייצור ROS המופעל באמצעות אור, 24 שעות לאחר הטרנספקציה הסר את מדיום התרבית והוסף 10 מיקרוליטר של ליגנד HaloTag TMR 200 ננו-מולרי או 200 ננו-מולרי Janelia Fluor 646 HaloTag ligand על מיקרו-באר זכוכית 20 מילימטר. מעבירים את התבשיל לאינקובטור של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני ומשאירים אותו למשך שעה כדי להכתים את התאים. לאחר שעה, מסירים היטב את מצע הכתמים ומוסיפים מיליליטר אחד של מדיום תרבית טרי.
מניחים צלחת בעלת תחתית זכוכית המכילה את התאים הרצויים על מיקרוסקופ קונפוקלי סורק לייזר המצויד באינקובטור על הבמה. בתוכנה, לחץ על חלון כלי, בחר Ocular, ולחץ על כפתור DIA כדי להפעיל את האור המועבר. צפו בצלחת דרך עינית המיקרוסקופ והביאו את התאים למיקוד על ידי סיבוב ידית המיקוד.
בחר LSM ולחץ על גלאי הצבעים בחר כפתור. לחץ פעמיים על הצבעים הרצויים בחלון הקופץ כדי לבחור את הגדרות הלייזר והסינון המתאימות להדמיית התאים. לחץ על Live4x בחלונית Live כדי להתחיל סריקת לייזר מהירה כדי להתחיל לסנן את האותות הפלואורסצנטיים של התאים.
הזז את הבמה באמצעות בקר הג'ויסטיק ואתר את התאים המבטאים diKillerRed VKSKL או SLP-VKSKL המדיום כדי להפעיל לחץ ROS על הפרוקסיזומים. לרכוש תמונה של התא הרצוי. לחץ על חלון הכלי ובחר גירוי LSM.
לאחר מכן לחץ על כפתור האליפסה ובחלון Live Image השתמש בעכבר כדי לצייר החזר השקעה בקוטר של 15 מיקרומטר המכיל את הפרוקסיזומים הרצויים שעליהם יופעל לחץ ROS. כדי להחיל לחץ ROS, השתמש ב- 561 ננומטר עבור תאים עם ליגנד SLP שכותרתו diKillerRed VKSKL או TMR והשתמש ב- 640 ננומטר עבור תאים המוכתמים בליגנד SLP של Janelia Fluor 646. בחר את אורך גל הלייזר להחלת מתח ROS.
הזן את אחוז הלייזר הרצוי ואת משך הזמן. לייצור ROS בפרוקסיזומים, לחץ על רכש ולאחר מכן על כפתור הגירוי כדי להתחיל את הסריקה עם 561 או 640 ננומטר של אור דרך החזר ההשקעה למשך 30 שניות כל אחד. גירוי זה מתאים לכ-5% הגדרות עוצמת לייזר עבור 561 ו-640 ננומטר.
לאחר 30 שניות של תאורת לייזר, פרוקסיזומים בתוך החזר ההשקעה מאבדים את אותות diKillerRed VKSKL, TMR או Janelia Fluor 646. אובדן אות זה מאפשר להבחין בין הפרוקסיזומים המוארים והלא מוארים בתוך התא. כדי לנטר את התאים החיים של הפקסופאג'ים, עקבו אחר הטרנסלוקציה של Stub1, Hsp70, ubiquitin, p62 או LC3B המתויגים ב-EGFP על הפרוקסיזומים המוארים או בעלי הלחץ של ROS על ידי הדמיה בהילוך מהיר תוך שימוש במרווחים של 10 דקות בין פריימים.
תאורה מוקדית מובילה לייצור ROS מיידי ומקומי בתוך פרוקסיזומים בודדים, כפי שצוין על ידי כתב הפלואורסצנט roGFP2-VKSKL. תמונת diKillerRed VKSKL צולמה לאחר שכל המדידות של roGFP2-VKSKL נעשו כדי לציין את מיקום הפרוקסיזומים הפגומים. הנתונים מראים גם כי פרוקסיזומים לא מוארים אינם מושפעים, מה שמצביע על דיוק המתודולוגיה.
מתודולוגיה זו שימשה לניטור פקסופאגיה בתיווך Stub1. במהלך תהליך זה, Hsp70, Stub1, חלבונים יוביקוויטינציה, מתאמי אוטופגיה p62 ו- LC3B מופיעים לאחר מכן בפרוקסיזומים בסטרס ROS כדי להניע פקסופגיה. באמצעות אותה אסטרטגיה, ניתן היה לפגוע בו זמנית בכל הפרוקסיזומים על צלחת תרבית לצורך אפיון ביוכימי של פקסופאגיה בתיווך Stub1.
לפני תאורת ה-LED, פלואורסצנטיות EGFP-ubiquitin הייתה הומוגנית בציטופלסמה ולא התמזגה עם הפרוקסיזומים. לאחר תשע שעות של תאורת LED, אותות EGFP-ubiquitin הצטברו על כל הפרוקסיזומים בתאים שגדלו בצלחת קונפוקלית. באמצעות פרוטוקול זה, מצאנו כי פרוקסיזומים בסטרס של ROS מוסרים דרך מסלול פירוק תלוי יוביקוויטין.
פרוקסיזומים בלחץ ROS מגייסים את היוביקוויטין E3 ליגאז Stub1 כדי לאפשר את הסרתם על ידי פקסופגיה.
