Peroksizomlar beta oksidasyonunu gerçekleştirir ve ROS hasarına eğilimlidir. Bu yöntem, hücrelerin ROS stresli peroksizomlarla nasıl başa çıktıklarını araştırmaya izin verir. Bu protokol sadece bir hücre popülasyonundaki tüm peroksizomları küresel olarak hedeflemek için kullanılmaz, aynı zamanda tek hücreler içindeki bireysel peroksizomların manipülasyonuna da izin verebilir.
Boya destekli ROS üretimi, hücrelerin organel yaralanmalarıyla nasıl başa çıktığını araştırmak için peroksizomların dışındaki organelleri hedeflemek için de kullanılabilir. Başlamak için, 20 milimetre çapında cam tabanlı 35 milimetrelik kültür kaplarına 840 mikrolitre kültür ortamında iki kez 10 ila beşinci insan SHSY5Y hücrelerine veya altı kez 10 ila dördüncü fare NIH H3T3 hücrelerine tohum ekleyin. Hücreleri 24 saat boyunca 37 santigrat derecede% 5 karbondioksit altında büyütün.
Daha sonra, bir transfeksiyon reaktifi veya SHSY5Y hücre transfeksiyonu kullanarak hücreleri istenen plazmidlerle transfekte edin. Plazmidleri 55 mikrolitre serumsuz DMEM/F-12 içinde seyreltin ve bir mikrolitre transfeksiyon reaktifini 55 mikrolitre serumsuz DMEM/F-12 ile seyreltin. Seyreltilmiş DNA'yı seyreltilmiş reaktif ile birleştirin.
Yavaşça karıştırın ve oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. Kompleksi, daha önce antibiyotiksiz SHSY5Y hücreleri içeren 100 mikrolitre kültür ortamı ile kaplanmış 20 milimetrelik mikro kuyucuğa ekleyin. Tabağı yavaşça ileri geri sallayın.
Daha önce gösterildiği gibi NIH 3T3 hücre transfeksiyonu gerçekleştirin, ancak plazmid seyreltme ve transfeksiyon reaktifi için serumsuz DMEM / F-12 yerine azaltılmış serum ortamını kullanın. İki saatlik transfeksiyondan sonra, transfeksiyon reaktifi içeren ortamı çıkarın ve bir mililitre taze kültür ortamı ekleyin. NIH 3T3 veya SHSY5Y hücrelerini 37 santigrat derecede ve% 5 karbondioksitte 24 saat boyunca inkübe edin.
Işıkla aktive edilen ROS üretimi için, transfeksiyondan 24 saat sonra kültür ortamını çıkarın ve 20 milimetrelik cam mikro kuyucuğa 10 mikrolitre 200 nanomolar HaloTag TMR ligand veya 200 nanomolar Janelia Fluor 646 HaloTag ligand ekleyin. Çanağı 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksit inkübatörüne aktarın ve hücreleri boyamak için bir saat bekletin. Bir saat sonra, boyama ortamını iyice çıkarın ve bir mililitre taze kültür ortamı ekleyin.
İstenilen hücreleri içeren cam tabanlı bir tabağı, bir sahne üstü inkübatör ile donatılmış bir lazer taramalı konfokal mikroskop üzerine yerleştirin. Yazılımda, Araç Penceresi'ne tıklayın, Oküler'i seçin ve iletilen ışığı açmak için DIA düğmesine tıklayın. Çanağı mikroskop göz merceğinden görüntüleyin ve odak düğmesini çevirerek hücreleri odak noktasına getirin.
LSM'yi seçin ve Boya Dedektörü Seç düğmesine tıklayın. Hücreleri görüntülemek için uygun lazer ve filtre ayarlarını seçmek için açılır pencerede istediğiniz boyalara çift tıklayın. Hücrelerin floresan sinyallerini taramaya başlamak üzere hızlı lazer taramayı başlatmak için Canlı panelde Live4x'e tıklayın.
Joystick kontrol cihazını kullanarak sahneyi hareket ettirin ve peroksizomlara ROS gerilimi uygulamak için orta diKillerRed VKSKL veya SLP-VKSKL eksprese eden hücreleri bulun. İstediğiniz hücrenin görüntüsünü alın. Araç Penceresi'ne tıklayın ve LSM Stimülasyonu'nu seçin.
Ardından elips düğmesine tıklayın ve Canlı Görüntü penceresinde, ROS stresinin uygulanacağı istenen peroksizomları içeren 15 mikrometre çapında bir ROI çizmek için fareyi kullanın. ROS stresini uygulamak için, diKillerRed VKSKL veya TMR etiketli SLP ligandına sahip hücreler için 561 nanometre kullanın ve Janelia Fluor 646 etiketli SLP ligandı ile boyanmış hücreler için 640 nanometre kullanın. ROS gerilimini uygulamak için lazer dalga boyunu seçin.
İstediğiniz lazer yüzdesini ve süresini girin. Peroksizomlarda ROS üretimi için, her biri 30 saniye boyunca ROI'lerden 561 veya 640 nanometre ışıkla taramayı başlatmak için Acquire ve ardından Stimülasyon düğmesine tıklayın. Bu stimülasyon, 561 ve 640 nanometre için yaklaşık% 5 lazer gücü ayarlarına karşılık gelir.
30 saniyelik lazer aydınlatmadan sonra, ROI'lerdeki peroksizomlar diKillerRed VKSKL, TMR veya Janelia Fluor 646 sinyallerini kaybeder. Bu sinyal kaybı, hücre içindeki ışıklı ve ışıksız peroksizomların ayırt edilmesini sağlar. Peksofaj canlı hücrelerini izlemek için, EGFP etiketli Stub1, Hsp70, ubiquitin, p62 veya LC3B'nin, kareler arasında 10 dakikalık aralıklarla hızlandırılmış görüntüleme ile aydınlatılmış veya ROS stresli peroksizomlara translokasyonunu izleyin.
Fokal aydınlatma, floresan muhabir roGFP2-VKSKL tarafından belirtildiği gibi bireysel peroksizomlarda anlık ve lokalize ROS üretimine yol açar. diKillerRed VKSKL görüntüsü, hasarlı peroksizomların yerini belirtmek için tüm roGFP2-VKSKL ölçümleri yapıldıktan sonra alındı. Veriler ayrıca, aydınlatılmamış peroksizomların etkilenmediğini ve metodolojinin hassasiyetini gösterdiğini göstermektedir.
Bu metodoloji Stub1 aracılı peksofajiyi izlemek için kullanıldı. Bu işlem sırasında, Hsp70, Stub1, ubikitinlenmiş proteinler, otofaji adaptörleri p62 ve LC3B daha sonra peksofajiyi yönlendirmek için ROS stresli peroksizomlarda ortaya çıkar. Aynı stratejiyi kullanarak, Stub1 aracılı peksofajinin biyokimyasal karakterizasyonu için bir kültür kabındaki tüm peroksizomlara aynı anda zarar vermek mümkündü.
LED aydınlatmadan önce, EGFP-ubikitin floresansı sitoplazmada homojendi ve peroksizomlarla kolokalize değildi. Dokuz saatlik LED aydınlatmadan sonra, EGFP-ubikitin sinyalleri, konfokal bir kapta yetiştirilen hücrelerdeki tüm peroksizomlar üzerinde birikti. Bu protokolü kullanarak, ROS stresli peroksizomların ubikitine bağımlı bir bozunma yolu ile uzaklaştırıldığını bulduk.
ROS stresli peroksizomlar, peksofaji ile uzaklaştırılmalarına izin vermek için ubikitin E3 ligaz Stub1'i işe alır.
