Este protocolo permite la visualización de células epiteliales durante la cicatrización de heridas en animales vivos. Nos permite ver cómo se comportan las células en su complejo entorno natural. Esta técnica introduce reactivos en la matriz extracelular y el citoplasma celular para estudiar el efecto de estos reactivos en la propagación y migración celular durante la cicatrización de heridas en animales vivos.
La cicatrización de heridas epiteliales y Clytia se parece notablemente a la curación en animales más complejos. Por lo tanto, podemos aprender mucho de este sistema sobre los mecanismos de curación de heridas y cómo se originaron. Demostrando estos procedimientos estarán Elizabeth Lee y la técnica de investigación Emily Watto.
Para comenzar el proceso de herido, prepare una pipeta de transferencia modificada cortando la punta de la pipeta con tijeras, creando una abertura ampliada que mide aproximadamente 0.5 a 0.7 centímetros de diámetro. Usando la pipeta de transferencia modificada, coloque la medusa recolectada de las colonias de pólipos establecidas en un portaobjetos de depresión, con el paraguas Medusa X hacia arriba. Asegúrese de que solo una cantidad suficiente de agua de mar artificial, o ASW, cubra al animal.
Para crear micro heridas dentro y entre las células, coloque un cubreobjetos sobre el animal. El cubreobjetos comprime la mesoglea y el rebote del tejido comprimido fuerza a las células ligeramente separadas. Imagen del animal inmediatamente para observar las micro heridas creadas.
Para crear pequeñas heridas epiteliales, coloque la medusa en un portaobjetos de depresión con el paraguas Medusa X hacia arriba, utilizando una pipeta de transferencia modificada, como se demostró anteriormente. Con una punta de pipeta de 200 microlitros, raye suavemente la superficie de la medusa. El rascado suave puede crear rasgaduras en la membrana basal.
Cubra al animal con un cubrebocas para obtener imágenes. Colocar el cubreobjetos a veces es suficiente para crear pequeñas heridas epiteliales incluso sin rascarse. Prepare una aguja de microinyección, utilizando un pilar de micropipeta y un tubo capilar de vidrio, siguiendo los pasos descritos en el texto.
Coloque la aguja de microinyección vacía en un soporte de microinyección fijado a un micromanipulador y corte la punta de la aguja, de modo que la abertura sea de aproximadamente 20 a 40 micras. Ajuste la presión de retención en el microinyector a cero y la presión de eyección a aproximadamente 20 libras por pulgada cuadrada. Ajuste el microinyector para que emita un pulso de aire de dos segundos.
Para crear grandes heridas epiteliales, coloque la medusa en un portaobjetos de depresión, como se demostró anteriormente. Usando el micromanipulador, ajuste la punta de la aguja de microinyección para que permanezca justo por encima del agua, sumergiendo cuidadosamente la punta en el agua y luego retrayéndola de tal manera que esté cerca de la superficie epitelial de la medusa. Pulse el aire presionando el botón de arranque en el inyector.
Repita el pulso en el mismo lugar de dos a cuatro veces, dependiendo del ancho de la punta. Las puntas más grandes requieren menos pulsos. Cubra al animal herido con un cubreobjetos para obtener imágenes de heridas grandes.
Ajusta el enfoque al paraguas x. Las celdas hexagonales deben ser claras. Identifique manualmente una herida para obtener una imagen de ella.
Inicie un programa que recopile imágenes como una película en tiempo real, o uno que recopile una serie de imágenes a intervalos regulares. Supervise el progreso para asegurarse de que el área de la herida no se desvíe del campo de visión y que las células de interés permanezcan enfocadas. Para inyectarse tintes y drogas, haga una aguja de microinyección siguiendo los pasos descritos en el texto.
Rellene la aguja de microinyección con una punta de pipeta larga con un exceso de volumen de tinte o medicamento para inyección en la medusa. Usando una pipeta de transferencia modificada, coloque una medusa con el subparaguas hacia arriba en el polidimetilsiloxano, o plato de inyección PDMS, con el ASW suficiente para cubrir al animal. Coloque el plato en una etapa de un microscopio de disección.
Concéntrese en la punta de la aguja de microinyección y avance hacia el agua cerca de la medusa. Con el micromanipulador, presione la aguja en el plato hasta que se doble y se rompa. Creación de una abertura de punta de aproximadamente 10 a 20 micras.
Usando el micro manipulador, inserte la punta de la aguja a través del subparaguas en la mesoglea sin perforar el paraguas X. En el microinyector, ajuste la presión de retención a cero y la presión de inyección por debajo o igual a 20 libras por pulgada cuadrada. Inyecte en uno o dos cuadrantes, llenando cada uno con una mancha de tinte o droga aproximadamente una cuarta parte del área de ese cuadrante.
Dependiendo del tinte o droga que se inyecte, los animales se colocan en un vaso de precipitados de ASW fresco para permitir la difusión e incubación del tinte o la droga. Para obtener imágenes, monte la medusa en un portaobjetos de depresión con una pipeta de transferencia modificada, colocando al animal con el paraguas X hacia arriba. Los animales pueden ser heridos en esta etapa para probar el efecto de un reactivo inyectado.
Las micro heridas dentro y entre las células formaron pequeños lamellipodia durante el cierre de la herida. Esto fue seguido por la contracción, y las heridas sanaron en menos de un minuto. Las pequeñas heridas epiteliales también se curaron a través de la formación de lamellipodia y la extensión de los contactos de lamellipodia.
El cierre rápido y progresivo de la herida precedió a la contracción del tejido a lo largo de la costura de la herida recién formada. La tasa de cicatrización normalizada de dos heridas pequeñas expresada como porcentaje del área total de la herida a lo largo del tiempo indicó cierta variabilidad en la dinámica de cierre de la herida. Se utilizaron datos de 14 heridas diferentes para establecer una curva de cicatrización media de heridas en animales no tratados.
En una pequeña herida que tiene daño en la membrana basal, las células marginales se extienden alrededor del área dañada y la brecha se cierra con una contracción de la cuerda del bolso. Cuando el tejido estaba deshidratado o demasiado dañado para repararlo, los movimientos celulares podían detenerse o toda la lámina de células podía estallar. Grandes heridas curadas en varias etapas.
El alisamiento del borde después de las contracciones en el margen, la formación de lamellipodia y la extensión de los contactos de lamellipodia en la migración celular colectiva en, y varios niveles celulares lejos de, el margen cerró grandes brechas. La tinción nuclear y de membrana se logró mediante la microinyección de los reactivos en la ECM. La microinyección de citocalasina B inhibió la formación de lamellipodia después de la herida.
Maneje a los animales con cuidado. Al inyectar reactivos, asegúrese de que la punta de la aguja de microinyección esté en la mesoglea y no haya atravesado completamente al animal. Actualmente, los animales transgénicos se están haciendo con proteínas de marcado fluorescente, la fluorescencia combinada y la microscopía de contraste interferente diferencial darán una imagen aún más clara de los eventos celulares en la cicatrización de heridas epiteliales.
