Nuestro protocolo proporciona un medio de cóctel para prolongar la vida útil de los neutrófilos a más de cinco días sin comprometer las funciones de los neutrófilos. También ofrece diálisis in vitro confiable para neutrófilos. El tratamiento con CLON-G amplía las posibilidades de preservación, transporte y manipulación de genes de neutrófilos, lo que puede acelerar la investigación en la comunidad de neutrófilos.
Para comenzar, prepare el medio básico agregando RPMI 1640 FBS y pen-strep a un tubo de 50 mililitros. Simultáneamente, descongele todas las soluciones madre de los componentes CLON-G en hielo. Luego diluir HSP 70 y 200 microgramos por mililitro de G-CSF en el medio básico.
Transfiera 976 microlitros de medio básico a un tubo de centrífuga de 15 mililitros. A esto, agregue los componentes CLON-G para preparar un mililitro de medio 2x CLON-G como se describe en el manuscrito. A continuación, prepare el cultivo de neutrófilos suspendiendo los neutrófilos de ratón aislados en el medio básico.
Añadir el medio CLON-G, seguido del medio básico a 24 placas bien no cultivadas en tejidos. Luego agregue 100 microlitros de la suspensión celular preparada y pipete suavemente de tres a cuatro veces. Incubar la placa de cultivo a 37 grados centígrados con un suministro de dióxido de carbono al 5%.
Manchar los neutrófilos cultivados con citospín y analizarlos usando un microscopio óptico. Para el análisis de citometría de flujo, agregue un mililitro de medio celular al cultivo de células de neutrófilos cultivado durante la noche. Mezcle el medio de cultivo celular pipeteándolo suavemente de cinco a siete veces y transfiera 100 microlitros de esta mezcla a un tubo de citometría de flujo en los puntos de tiempo deseados.
Simultáneamente, vortex las perlas de conteo y pipeta de 10 microlitros de solución de perlas al mismo tubo de citometría de flujo que contiene el medio celular. Agregue 10 microlitros de una mezcla de tinción preparada previamente a este tubo de citometría de flujo e incube durante cinco minutos en el refrigerador bajo la oscuridad. Luego agregue 100 microlitros de solución salina al tubo y mezcle bien para una distribución uniforme de las perlas y células de conteo.
Finalmente, realizar el análisis de citometría de flujo de la suspensión celular como se describe en el texto manuscrito. Para el ensayo de imágenes fluorescentes, agregue dos mililitros de suspensión celular por placa confocal e incube a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono. Mientras tanto, disuelva un gramo de cloruro de calcio en 45 mililitros de solución salina y fílelo con una unidad de filtrado de 0,2 micrómetros.
Retire suavemente la placa confocal en el momento requerido. Tiñir las células con 10 microlitros de FITC-Annexin-V, PI y cloruro de calcio durante cinco minutos a temperatura ambiente. Luego, usando un microscopio de fluorescencia confocal, capture las imágenes utilizando los canales deseados.
En el presente estudio, la morfología de los neutrófilos no se vio afectada en el medio CLON-G incluso después de cinco días. Además, los fenotipos de fax demostraron células intactas después del tratamiento. El análisis de citometría de flujo mostró una población positiva de neutrófilos no tratados en la anexina-V y la pérdida de población podría deberse al ácido etilendiamina tetraacético en el medio celular.
Sin embargo, la viabilidad de los neutrófilos tratados con CLON-G a las 24 horas fue de aproximadamente más del 90%. Los neutrófilos cultivados en el medio básico durante 24 horas mostraron células hinchadas y la pérdida de estas células podría haber resultado de la sacudida o pipeteo de la placa confocal. Las concentraciones y los efectos del compuesto CLON-G pueden afectar significativamente las pruebas de neutrófilos.
Si es posible, evite modularlos. Las investigaciones de neutrófilos son laboriosas, costosas y extremadamente limitadas en su aplicación clínica debido a su corta vida útil. Este método supera parcialmente estos obstáculos.
