Los organismos muestran una tremenda variedad en sus formas. Estamos muy interesados en los mecanismos moleculares y celulares que subyacen a la formación, diversificación y evolución de estas formas. Para entender esto, hemos estado investigando cómo las células determinadas por el destino forman la forma final de la pata adulta en Drosophila.
Usando imágenes en vivo, hemos encontrado un comportamiento inesperadamente sorprendente de las células. Durante la formación de la forma final de la pierna, las células epiteliales formaron transitoriamente la estructura especial que denominamos la estructura similar al Partenón. Esta estructura parece ser una característica general de las células epiteliales a medida que establecen su forma final Para obtener imágenes en vivo a largo plazo durante la etapa de pupa, es importante eliminar el pupario mientras se mantiene la humedad.
Nuestro método, que utiliza un plato con fondo de cristal y una gota de agua, es estable, fiable y fácil de manejar, incluso para los principiantes. Nuestros resultados demuestran que las células experimentan cambios dinámicos inesperados de forma durante el proceso final de formación de la forma. Para comprender con precisión los mecanismos de formación de la forma final, es esencial comprender a fondo los cambios continuos en la forma de la célula e investigar los mecanismos detrás de estos cambios y su importancia para la morfogénesis.
Las siguientes preguntas que queremos abordar son cómo se forma transitoriamente la estructura similar al Partenón y cómo contribuye a la formación de formas más finas. Para comenzar, recoja pupas blancas de la cepa deseada de Drosophila melanogaster de viales y colóquelas en platos o viales vacíos con un pincel. Incubar las pupas blancas recolectadas a 25 grados centígrados durante al menos 14 horas hasta que alcancen la etapa deseada para la observación.
Con un pincel empapado en agua destilada, retire con cuidado el pegamento y la comida para moscas de la superficie del pupario. A continuación, coloque las pupas limpias sobre toallitas limpiadoras y déjelas secar durante varios minutos. Ahora coloque un trozo de cinta adhesiva de doble cara en un portaobjetos de vidrio y coloque las pupas secas en la cinta de doble cara con el lado ventral hacia abajo.
Con un pincel seco, empuje suavemente el lado dorsal de las pupas para mejorar la adherencia a la cinta adhesiva de doble cara. Bajo un microscopio estereoscópico, use un par de pinzas para abrir cuidadosamente el opérculo del pupario. Inserte una punta de las pinzas en el espacio entre la pupa y el pupario desde el borde del opérculo abierto.
Luego, con las pinzas, agarre el pupario y tire de él hacia afuera hasta que se abra. Levanta los fragmentos desgarrados del pupario y adhiérelos a la cinta adhesiva de doble cara. Para comenzar, prepare la pata de la pupa de Drosophila melanogaster para la toma de imágenes.
Dependiendo de la lente utilizada, aplique un microlitro de agua destilada o aceite de silicona en el fondo de un plato con fondo de vidrio. A continuación, remoja un pincel en agua destilada y recoge suavemente la pupa. Coloque la pupa con el lado ventral hacia abajo sobre el agua destilada o el aceite de silicona en el plato.
Con una micropipeta, agregue 10 microlitros de agua destilada cerca del borde de la porción de vidrio del plato. Con una jeringa, aplique un círculo de grasa de silicona alrededor del borde de la porción de vidrio del plato. A continuación, coloque un cubreobjetos sobre la grasa de silicona para sellar el plato.
Después de encender el microscopio confocal y el software, coloque el plato con fondo de vidrio con la pupa en la platina del microscopio y obtenga una imagen del área de interés deseada. Las células epiteliales del tarso formaron proyecciones basales apicobasales y conexiones basales, que recuerdan al Partenón entre 16 horas y 27,5 horas después de la formación del pupario. Se observó una reducción progresiva del grosor epitelial entre 41 y 60 horas después de la formación del pupario, incluso después de que el contorno del tejido de la pierna se volviera más definido.
