Os organismos mostram uma tremenda variedade em suas formas. Estamos altamente interessados nos mecanismos moleculares e celulares subjacentes à formação, diversificação e evolução dessas formas. Para entender isso, investigamos como as células determinadas pelo destino formam a forma final da perna adulta em Drosophila.
Usando imagens ao vivo, encontramos um comportamento inesperadamente surpreendente das células. Durante a formação da forma final da perna, as células epiteliais formaram transitoriamente a estrutura especial, como chamamos de estrutura semelhante ao Partenon. Essa estrutura parece ser uma característica geral das células epiteliais à medida que estabelecem sua forma final Para imagens ao vivo de longo prazo durante o estágio de pupa, é importante remover o pupário enquanto mantém a umidade.
Nosso método, que usa um prato com fundo de vidro e uma gota de água, é estável, confiável e fácil de manusear, mesmo para iniciantes. Nossos resultados demonstram que as células sofrem mudanças inesperadas de forma dinâmica durante o processo de formação da forma final. Para entender com precisão os mecanismos de formação da forma final, é essencial compreender completamente as mudanças contínuas na forma da célula e investigar os mecanismos por trás dessas mudanças e sua importância para a morfogênese.
As próximas questões que queremos abordar são como a estrutura semelhante ao Partenon é formada transitoriamente e como ela contribui para a formação de formas mais finas. Para começar, colete pupas brancas da cepa desejada de Drosophila melanogaster de frascos e coloque-as em pratos ou frascos vazios usando um pincel. Incubar as pupas brancas coletadas a 25 graus Celsius por pelo menos 14 horas até que atinjam o estágio desejado para observação.
Usando um pincel embebido em água destilada, remova cuidadosamente a cola e a comida da superfície do pupário. Em seguida, coloque as pupas limpas em lenços umedecidos e deixe-as secar por alguns minutos. Agora prenda um pedaço de fita dupla-face a uma lâmina de vidro e coloque as pupas secas na fita dupla-face com o lado ventral voltado para baixo.
Usando um pincel seco, empurre suavemente o lado dorsal das pupas para melhorar a adesão à fita dupla-face. Sob um microscópio estéreo, use uma pinça para abrir cuidadosamente o opérculo do pupário. Insira uma ponta da pinça no espaço entre a pupa e o pupário a partir da borda do opérculo aberto.
Em seguida, usando a pinça, segure o pupário e puxe-o para fora até que se abra. Levante os fragmentos rasgados do pupário e cole-os na fita dupla-face. Para começar, prepare a perna de pupa de Drosophila melanogaster para imagens.
Dependendo da lente usada, aplique um microlitro de água destilada ou óleo de silicone no fundo de um prato com fundo de vidro. Em seguida, molhe um pincel em água destilada e retire delicadamente a pupa. Coloque a pupa com o lado ventral voltado para baixo sobre a água destilada ou óleo de silicone no prato.
Usando uma micropipeta, adicione 10 microlitros de água destilada perto da borda da porção de vidro do prato. Usando uma seringa, aplique um círculo de graxa de silicone ao redor da borda da parte de vidro do prato. Em seguida, coloque uma lamínula sobre a graxa de silicone para selar o prato.
Depois de ligar o microscópio confocal e o software, coloque o prato de fundo de vidro com a pupa no microscópio stage e imagine a área de interesse desejada. As células epiteliais do tarso formaram projeções basais apicobasais e conexões basais, que lembram o Partenon entre 16 horas e 27,5 horas após a formação do pupário. Observou-se redução progressiva da espessura epitelial de 41 horas para 60 horas após a formação do pupário, mesmo após o contorno do tecido da perna ficar mais definido.
