El establecimiento de un cultivo líquido cubierto de las vías respiratorias humanas epiteliales polarizadas Calu-3 células para estudiar la respuesta del huésped celular a patógenos respiratorios<em&gt; In vitro</em

Resumen

Los resultados y conclusiones de este informe son las de los autores y no necesariamente representan las opiniones de los Centros para el Control y Prevención de Enfermedades.

Resumen

Las superficies apical y basolateral de las células epiteliales de las vías respiratorias demostrar respuestas direccionales de la exposición patógeno in vivo. Por lo tanto, ideal en modelos in vitro para el examen de las respuestas celulares a patógenos respiratorios polarizan, formando superficies apical y basolateral. Uno de estos modelos se diferencian normales células epiteliales bronquiales humanas (NHBE). Sin embargo, este sistema requiere muestras de tejido pulmonar, la experiencia aislar y cultivar células epiteliales de tejido, y el tiempo para generar una cultura interfase aire-líquido.

Calu-3 células, derivadas de un adenocarcinoma bronquial humano, son un modelo alternativo para el examen de la respuesta de las células epiteliales de vías respiratorias proximales al insulto respiratoria ^1, los compuestos farmacológicos ^{2-6, 7-9} y bacterianas y patógenos virales, incluyendo el virus de la influenza, rinovirus y el síndrome respiratorio agudo severo - coronavirus asociado al ^10-14. Recientemente, we demostrado que Calu-3 células son susceptibles a virus sincitial respiratorio (RSV) en una manera consistente con NHBE ^15,16. Aquí, detalles de la creación de un polarizada, líquido cubierto de cultivo (LCC) de Calu-3 células, centrándose en los detalles técnicos de crecimiento y cultivo de células Calu-3, el mantenimiento de las células que han sido cultivadas en LCC, y se presenta el método para realizar la infección de virus respiratorio polarizadas Calu-3 células.

Para obtener de forma polarizada Calu-3 LCC, Calu-3 células deben ser cuidadosamente subcultivaron antes de cultivar en inserciones Transwell. Calu-3 cultivos en monocapa debe permanecer por debajo de 90% de confluencia, se debe subcultivar menos de 10 veces de stock congelado, y regularmente debe ser suministrado con medio fresco. Una vez cultivadas en transwells, Calu-3 LCC debe ser manejado con cuidado. Los cambios de medios irregulares y la interrupción mecánica o física de las capas de células o placas de polarización para impactar negativamentevarias horas o días. La polarización se controla mediante la evaluación de trans-epitelial resistencia eléctrica (TEER) y se verificó mediante la evaluación de la equilibración pasiva de fluoresceína de sodio entre los compartimentos apical y basolateral ^17,18. Una vez mesetas TEER igual o superior a 1000 Ω x cm ^2, Calu-3 LCC está listo para usar para examinar la respuesta celular a los patógenos respiratorios.

Protocolo

1. Cultivo de células Calu-3 para el uso en las culturas Transwell

Medidas de seguridad: Realice todos los procedimientos en un gabinete de bioseguridad mediante la técnica de cultivo estéril.

1. Para descongelar las células de almacenamiento de congelados:
   1. Preparar medio esencial mínimo de Eagle que contiene 20% inactivado por calor suero fetal bovino (FBS), 0,1 mM no aminoácidos esenciales, 2 mM L-glutamina, y 10 mM de HEPES, pH 7,4 (EMEM-20% + S). -Filtro estéril el medio preparado usando un 0,2 micras de tamaño de poro del filtro, y caliente en un baño de agua a 37 ° C. Para ser más reflexiva del entorno in situ en el epitelio de las vías respiratorias, medio no está suplementado con antibióticos o antimicóticos.
   2. Descongelar un criovial congelado de Calu-3 células rápidamente (<1 min) en un baño de agua a 37 ° C.
   3. Transfiera las células descongeladas a un tubo cónico de 50 ml estéril y añadir 30 ml de EMEM-20 calentado% + S.
   4. Sedimentar las células por centrifugación durante 5 min a 1,000-1,200 × g,sin refrigeración, y con la velocidad de frenado bajo.
   5. Decantar suavemente el sobrenadante y resuspender las células en 5 ml de EMEM caliente-20% + S pipeteando suavemente arriba y abajo. Semilla 2 a 5 x 10 ⁶ células por pocillo en una placa de cultivo tisular de 6 pocillos y se incuba a 37 ° C, 7% de CO ₂ en la atmósfera de aire hasta que las células son 75% - 80% confluente. Revise diariamente, hasta 7 días que sean necesarios. Cada 3-4 días aspirar el medio de las células y reemplazar con agua fresca EMEM-20% + S.
2. Para las células subcultura:
   1. Tripsina 0,05% tibia - 0,02% de EDTA en un baño de agua a 37 ° C. Aspirar el medio de las células, y lavar las células una vez con tripsina calentada 0,05% - 0,02% de EDTA para eliminar el exceso de medio y suero. Eliminar el lavado y añadir 1 ml de tripsina calentado por pocillo a las células.
   2. Incubar a 37 ° C y 7% de CO ₂ y el monitor bajo un microscopio cada 5 minutos hasta al menos 75% de células se separen del pozo (s) de la placa de cultivo de tejidos. Esto puedetomar entre 5 y 30 min.
   3. Lavar las células en EMEM-20% + S para eliminar el exceso de tripsina. Transferir las células tratadas con tripsina a un tubo cónico de 50 ml estéril. Varios pocillos de las células de una placa de cultivo de 6 pocillos se pueden mezclar en un tubo cónico de 50 ml estéril. Añadir 30 ml de EMEM-20% + S y sedimentar las células por centrifugación a 1,000-1,200 × g, sin necesidad de refrigeración, y con velocidad baja de freno.
   4. Decantar suavemente el sobrenadante y resuspender las células en EMEM fresco-20% + S pipeteando suavemente arriba y abajo. El uso de pasos a través de 1.2.1 1.2.3 arriba para Tripsinizar las células, las células continúan subcultivo en placas de cultivo de tejido como se describe en los pasos a través de 1.2.5 1.2.7 cuando están entre 75 - 80% confluente.
   5. Subcultivo de un pocillo de una placa de 6-y hasta un T-25 cm ² matraz en un volumen final de 5 ml de EMEM-20% + S, sembrando entre 0,5 a 1 x 10 ⁶ células / matraz.
   6. Uso de 5 ml de tripsina calentado por T-25 cm ² matraz para separar las células, subcultivode un T-25 cm ² matraz hasta un T-75 cm ² matraz en un volumen final de 10 ml de EMEM-20% + S, sembrando entre 1 a 5 x 10 ⁶ células / matraz.
   7. Con 8 ml de tripsina calentado por T-75 cm ² frasco para desprender las células, subcultura de un T-75 cm ² frasco en 2 T-75 cm ² frascos. Para el crecimiento celular óptimo, no células de subcultivo en matraces mayores de T-75 cm ² o subcultivo en una proporción mayor que matraz de matriz 1: 3 frascos nuevos.
3. Una vez que las células han sido subcultivadas, completamente quitar y reemplazar medio cada 2 a 3 días hasta que alcanzan 75-90% de confluencia. Las células pueden tomar hasta 3 semanas para llegar a 75-90% confluencia. Para la generación óptima de las culturas polarizadas, células subcultura antes de que crezcan más allá del 90% de confluencia en forma de monocapa.
4. Continuar con las células de subcultivo hasta que las células han crecido suficientes para sembrar el número deseado de inserciones Transwell. Cada inserto Transwell requiere 2 × 10 ⁵ células. Para obtener un rendimiento óptimo de la generación de cultivos polarizados, utilizar células que han sufrido no más de 10 subcultivos.

2. Crecimiento polarizadas Calu-3 líquido cubiertas Culturas (LCC)

Medidas de seguridad: Realice todos los procedimientos en un gabinete de bioseguridad mediante la técnica de cultivo estéril.

1. Preparar EMEM que contenía FBS al 10% (EMEM-10%) y se calienta en un baño de agua a 37 ° C.
2. Preparar una placa de 24 pocillos Transwell para la siembra. Utilizando pinzas estériles, inserciones Transwell de mover desde el interior de las filas exteriores de la placa sin tocar la membrana de inserción. Las células sólo se debe subcultivar en pocillos en las filas exteriores de la placa. Para evitar la introducción de burbujas de aire en los compartimentos basolaterales, añadir 600 l de EMEM-10% a cada uno inclinando la pipeta contra la pared de cada compartimento y liberar lentamente el medio en el pozo.
3. Separar las células de T-75 cm ² de tejido. Subculture matraces usando tripsina calentado, y lavar con 30 ml de EMEM-20% + S por cada 2 frascos de células tratadas con tripsina, como se describe en el paso 1,2.
4. A fondo resuspender las células lavadas en 5 ml de EMEM-10% pipeteando suavemente arriba y abajo.
5. Determinar el recuento de células viables y totales por el método de exclusión con azul de tripano. Procede sólo si 80% - 90% son viables.
6. En un tubo cónico de 50 ml estéril, diluir las células a una concentración de 2 x 10 ⁶ células viables / ml con EMEM-10%.
7. Añadir las células en el compartimiento apical de cada Transwell. A los pocillos A1 y D1, que será libres de células pocillos de control, es decir, espacios en blanco, añadir 100 ml de EMEM-10% sin células. Para cada uno de los pocillos restantes, añadir 100 ml de resuspensión de Calu-3 células, inclinando suavemente la pipeta contra el canal de guía interior de la pared del inserto y liberando lentamente las células. No toque la pipeta a la membrana de inserción. Para mantener una suspensión homogénea de Calu-3 células, agitar suavemente la suspensión celulardurante esta etapa de siembra.
8. Incubar la placa Transwell a 37 º C y 7% de CO ₂ en atmósfera de aire. Colocar la placa en una incubadora donde perturbación física será mínimo. Para mejorar la eficiencia de la polarización, no se apilan las placas en la parte superior de la otra.
9. Para mantener los cultivos hasta polarizada y listo para usar en los experimentos, reemplazar completamente medio en transwells, como se describe en los pasos a través de 2,10 2,13 continuación. Medio debe ser reemplazado por completo tres días después de que se subcultivan en transwells, y luego en un ciclo de alternancia entre el día cuarto y tercero continuación, después de la alimentación anterior, hasta que las células son completamente polarizada.
10. Warm EMEM-10% en un baño de agua a 37 ° C.
11. Suavemente aspirar medio de inserciones Transwell. Con una pipeta capilar conectado a una trampa de vacío con un vacío suave, o con un estándar de pipeta de 1 ml, medio aspirado de células libres de los pocillos A1 y D1, a continuación, a partir de semillas pozos, primero la eliminación de medio apical de todos los pocillos, y tla eliminación de gallina medio basolateral de todos los pocillos. No toque las membranas de inserción mientras se aspira medio.
12. Añadir 200 l de EMEM-10% para el compartimento apical de células libres de los pocillos A1 y D1, a continuación, a los pocillos sembrados, dirigir el medio en el compartimiento apical con el lateral de la pieza de inserción para guiar la punta de la pipeta. No agregue medio directamente en las células, y no toque la membrana de inserción.
13. Añadir 600 l de EMEM-10% de los compartimentos basolaterales. Para evitar la introducción de burbujas de aire en los compartimentos basolaterales, se añade medio a cada uno inclinando la pipeta contra la pared de cada compartimento y liberar lentamente el medio en el pozo.

3. Evaluación del Desarrollo de la Resistencia de Calu-3 LCC

Medidas de seguridad: Realice todos los procedimientos en un gabinete de bioseguridad mediante la técnica de cultivo estéril.

1. Evaluar trans-epitelial resistencia eléctrica (TEER) de Calu-3 LCC 30 min después decambios de medio; la evaluación se puede realizar después de cada cambio de medio, si se desea. Realizar mediciones bajo condiciones estériles. Comenzar las mediciones con pozos el control libre de células A1 y D1 (los espacios en blanco) para obtener mediciones de referencia, y continuar con las mediciones para cada pocillo.
   1. En condiciones estériles, transferir el electrodo stx2 a un tubo de centrífuga de 50 ml que contiene 70% de etanol en agua estéril, y esterilizar 15 min.
   2. Calibrar y probar el voltohmmeter para uso de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
   3. Retire el electrodo del etanol, el aire seco 5-10 segundos, y enjuague el electrodo con agua estéril EMEM-10%.
   4. Ajuste el selector de modo de la voltohmmeter al ajuste de resistencia y encender el equipo.
   5. Suavemente coloque el electrodo en uno de los 3 puertos que permiten el acceso al compartimiento basolateral de una cultura Transwell. Coloque el electrodo para que la iniciativa es sólo toque ligeramente el fondo del pozo externo y se mantiene vertical,y el cable más corto es en el medio de cultivo tisular del compartimiento apical, sin tocar la membrana de inserción.
   6. Empuje "Medida R" botón, y esperar a que la lectura se estabilice. Repetir para los otros 2 puertos para cada pocillo y registrar las mediciones de los tres puertos, para un total de tres mediciones por pocillo. Continuar para medir la resistencia de todos los pocillos de células.
   7. Limpiar el electrodo por remojo 5-10 min en 70% de etanol, lavado en dH ₂ O estéril, y secado a fondo. Conservar en el envase original.
   8. Calcular la resistencia de cada pocillo, utilizando la Ecuación 1.
      Ω = Ω _{real de la muestra} - Ω _{en blanco,} la ecuación 1
      donde la _muestra Ω es la medida media de un pozo sin semillas y _{en blanco} Ω es la medida promedio de los 2 pozos, A1 y ​​D1, que contiene las inserciones y medianas, pero las células no.
   9. Calcular la resistencia unidad de área, utilizando Equación 2.
      Ω _real x = área efectiva de la membrana × Ω cm ^2, la ecuación 2
      donde el área efectiva de la membrana es 0,33 cm ² para 24-así inserciones Transwell.
2. Compruebe que la polarización se completa mediante la realización de un ensayo secundario, la medición de la difusión pasiva de fluoresceína de sodio entre los compartimentos apical y basolateral, de una a tres cultivos Transwell. Los pozos utilizados para el ensayo de fluoresceína sódica deben ser desechados inmediatamente después de la finalización del ensayo.
   1. Prepare no fluorescente tampón (118 mM NaCl, 4,75 mM KCl, 2,53 mM CaCl ₂ .2 H ₂ O; 2,44 mM MgSO _4, 1,19 mM KH ₂ PO _4, 25 mM NaHCO ₃ en agua estéril; filtro estéril con 0,45 micras dispositivo de filtración ). Preparar fluoresceína de sodio a 1 mg / ml en tampón no fluorescente, filtro estéril, envolver en papel de aluminio, y se almacenan a 4 ° C, protegido de la luz. Calentar a habitación temvolver antes de su uso.
   2. Después de completar las mediciones de resistencia, retirar cuidadosamente medio de los compartimentos apical y basolateral de uno a tres cultivos individuales Transwell.
   3. Enjuague culturas Transwell. Suavemente añadir 600 l a temperatura ambiente estéril PBS de Dulbecco (D-PBS) a los compartimentos basolaterales y 100 l a temperatura ambiente estériles D-PBS a los compartimentos apical.
   4. Retire con cuidado D-PBS de los pozos. Añadir 600 l estéril no fluorescente tampón a los compartimentos basolaterales. Añadir 100 l estéril de 1 mg / ml de fluoresceína de sodio a los compartimentos apical.
   5. Incubar la placa a 37 ° C durante 1 hr. CO ₂ no es necesario durante esta incubación.
   6. Durante la incubación, preparar una curva estándar de fluoresceína sódica que oscila entre 20 mg / ml y 0 g / ml, utilizando no fluorescente tampón para diluir la fluoresceína sódica. Preparar al menos 8 diferentes concentraciones de fluoresceína de sodio, cada uno en un volumen final de al menos 600 l. Mantenerdiluciones de la curva estándar protegido de la luz hasta el momento de medir la absorbancia.
   7. Transferir la muestra tampón no fluorescente desde el compartimento basolateral de cada Transwell de prueba a un tubo limpio separado para el análisis. Eliminar la prueba transwells utilizado para examinar la difusión pasiva de fluoresceína de sodio de la placa y desechar. Devolver la placa con transwells restantes a la incubadora.
   8. Coloque 100 l de cada solución estándar por triplicado en un 96-pocillos de fondo plano placa.
   9. Preparar tres diluciones de cada muestra basolateral (1:2, 1:20, y 1:50) en tampón no fluorescente, y añadir 100 ml de cada muestra no diluida y de cada dilución, en duplicado, en un 96-bien plana placa de fondo.
   10. Medir la absorbancia de la muestra en un lector de placas de ELISA a 486 nm o 490 nm.
   11. Determinar la concentración de fluoresceína de sodio en el compartimento basolateral mediante la comparación de la absorbancia de las muestras en contra de los valores de absorbancia de la fluoresceína sódica stAndard curva.

4. Infección Polarized Calu-3 LCC con virus respiratorio

Medidas de seguridad: Realizar todos los procedimientos en un gabinete de seguridad biológica usando técnica de cultivo estéril, a un nivel de bioseguridad adecuado para el virus que se utiliza.

1. Diluir virus en EMEM libre de suero de modo que los inóculos deseado sería en 100 l.
2. Lavar las células en EMEM libre de suero. Suavemente aspirar medio de todos los pocillos, eliminando el medio apical luego el medio basolateral. Con una pipeta capilar conectado a una trampa de vacío con un vacío suave, o con un estándar de pipeta de 1 ml, medio aspirado de células libres de los pocillos A1 y D1, a continuación, a partir de semillas pozos, primero eliminando el medio apical de todos los pocillos, y después eliminando el medio basolateral de todos los pocillos. No toque las membranas de inserción mientras se aspira medio.
   1. Añadir 100 l de EMEM libre de suero para el compartimiento apical de células libres de los pocillos A1 y D1, y después a tél sin semillas pocillos, dirigiendo medio en el compartimiento apical con el lateral de la pieza de inserción para guiar la punta de la pipeta. No agregue medio directamente en las células, y no toque la membrana de inserción.
   2. Añadir 600 l de EMEM libre de suero a los compartimentos basolaterales. Añadir medio a cada Transwell inclinando la pipeta contra la pared del compartimento y liberar lentamente el medio en el pozo.
   3. Suavemente aspire el suero libre de medio de pozos.
3. Empezando con los pozos no infectados o infectados mock-, añadir las diluciones adecuadas de virus para el compartimento apical de transwells. Para los pozos no infectados, añadir 100 ml de EMEM libre de suero para el compartimento apical de transwells apropiados, por infección simulada pocillos, añadir 100 l de virus libre de la preparación diluida en EMEM libre de suero para el compartimento apical de transwells adecuadas, y por infección por virus, virus diluir en EMEM libre de suero y añadir 100 ml de los compartimentos apical de transwells apropiadas.
4. Añadir 600 l de EMEM libre de suero para todos los compartimentos basolaterales.
5. Incubar a 37 ° C y 7% de CO ₂ durante 2 horas.
6. Aspirar el medio de pozos, en primer lugar de los pozos infectados y no infectados por el simulacro, luego de los pozos infectados. Eliminar los sobrenadantes apicales primero, seguidos por los sobrenadantes basolateral.
7. Reemplazar medio con 200 l de EMEM-10% en los compartimentos apical y 600 l de EMEM-10% en los compartimentos basolaterales.

Resultados

Cuando se cultiva como líquido cubiertas de cultivos (LCC) en sistemas de cultivo Transwell, como se ilustra en la Figura 1, Calu-3 células en desarrollo, se polarizan las distintas superficies apical y basolateral. Siguiendo el método descrito aquí, la resistencia eléctrica transepitelial (TEER) de Calu-3 LCC alcanza una meseta en o por encima de 1.000 Ω cm × ² a 3 semanas después de la siembra, un ejemplo del cual se muestra en la Figura 2. Las uniones estrechas formadas entre células polarizadas prevenir equilibrado pasiva de pequeñas moléculas entre los compartimentos apical y basolateral. Así, un ensayo de fluoresceína sódica modificada de equilibración se utiliza para confirmar la polarización de Calu-3 LCC ^15,17,18. Como la TEER de monocapas de células Calu-3 en incrementos de LCC, la cantidad de fluoresceína que pasivamente se equilibra en el compartimento basolateral disminuye. Una vez que la TEER es 1.000 Ω cm × ^2, la cantidad de fluoresceína que se equilibra enpara el compartimento basolateral está ≤ 1%, como se muestra en la Figura 3, por lo tanto, Calu-3 LCC se considera que son completamente polarizada cuando la TEER es ≥ 1.000 Ω × ² cm. La medición TEER pico de Calu-3 LCC puede variar de experimento a experimento. Sin embargo, una vez TEER meseta valores para cualquier experimento dado, totalmente polarizado, sin infectar Calu-3 LCC puede ser estable durante 5 hasta las 12 semanas post-siembra. La ausencia de desarrollo de resistencia en Transwell-cultivadas Calu-3 puede ser causado por varios factores, tal como se indica en la Tabla 1. Una vez que la TEER de Calu-3 mesetas LCC en o por encima de 1.000 Ω cm × ^2, el modelo está listo para ser utilizado para examinar las vías respiratorias respuestas de las células epiteliales de los patógenos respiratorios, incluyendo el virus sincitial respiratorio (RSV). La exposición a los resultados de RSV en una disminución más rápida de la integridad de la cultura polarizada en comparación con una maqueta de la infección de células (Figura 4).

Figura 1. Células sección transversal de representación de Transwell-cultivos de células. Se cultivan en la superficie apical de la membrana de inserción.

Figura 2. Desarrollo de trans-epitelial resistencia eléctrica (TEER) y la polarización de Calu-3 células después de la siembra en insertos Transwell. En cada punto de tiempo, TEER se presentan como mediana Ω cm x ² ± SEM de 32 pocillos independientes de un experimento representativo.

Figura 3. Pasivo equili calibración de fluoresceína de sodio en el compartimento basolateral de las monocapas de células Calu-3 es inhibida como células polarizado. Los datos acumulados de cuatro experimentos independientes se presenta. Cada punto de datos representa una medición individual.

Figura 4. Infección por el RSV de polarizado Calu-3 LCC acelera la disminución de integridad de la monocapa. Polarized Calu-3 células fueron infectadas con RSV-A2 a una MOI = 1 en el día 0, y la polaridad se monitorizó durante 8 semanas después de la infección. Un experimento representativo se muestra. Los datos se presentan como mediana resistencia de 8 pocillos independientes por infección ± SEM por punto de tiempo. * P <0,05 entre culturas maqueta y RSV-A2-infectados, según se determina mediante el t-test.

formas "> Cuestión Resolución (s) La resistencia no es mensurable

• Eliminar las burbujas de aire en los pozos
• Use Calu-3 células que han sido subcultivadas de stock congelado menos de 10 veces
• No permita que Calu-3 células para alcanzar el 100% de confluencia en la subcultura monocapa
• Comprobar que las células no están creciendo en el plástico muy por debajo de la pieza de inserción (lo que indica que las células pueden haber crecido a través de los poros de la pieza de inserción)
• Permita 2-3 semanas después de la siembra para el desarrollo de resistencia completa
• Comprobar la composición y tamaño de poro de insertos utilizados, si es necesario cambiar (inserto de poliéster recomendada, 0,3 micras de tamaño de poro, no revestimientos, materiales para ver detalles)
• Comprobación de la calidad del electrodo, lijar suavemente para eliminar las proteínas acumuladas desde la punta, y si es necesario sustituir
• Ver medio para el crecimiento bacteriano

La resistencia se desarrolla, pero la polarización total (≥ 1000 Ω x cm ²⁾ no se alcanza

• Permitir tiempo adicional para la polarización de desarrollar (en ocasiones puede tardar hasta 4 semanas)
• Use Calu-3 células que han sido subcultivadas de stock congelado menos de 10 veces
• No permita que Calu-3 células para alcanzar el 100% de confluencia en la subcultura monocapa
• Consistentemente sustituir medio en cultivos Transwell, alternando entre el cuarto día de la tercera y luego después de la alimentación anterior
• Sólo las células de cultivo en insertos que se colocan en las filas exteriores de las placas
• Usar un lote diferente de inserciones Transwell

Las células completamente polarizar, pero la resistencia no es consistente entre una lectura y la siguiente

• No interrumpir ni apile las placas en la incubadora
• No provocan vibraciones en la cabina de bioseguridad mientras Transwell platES se están manejando
• Eliminar las burbujas de aire en los pozos
• No moleste a la capa de células con puntas de pipeta al cambiar los medios de comunicación o la realización de lecturas TEER
• Usar medio 200 l en el compartimento apical; menor volumen puede producir lecturas inestables TEER
• Compruebe la calidad del electrodo, lijar suavemente para eliminar las proteínas acumuladas en la punta, y reemplazar si es necesario

Tabla 1. Localización de Averías problemas que pueden surgir cuando se cultiva Calu-3 células en transwells. Múltiples factores contribuyen a la polarización completa de Calu-3 células en el líquido cubiertas de cultivos, los más probables de los cuales se destacan en esta tabla.

Discusión

Al establecer Calu-3 LCC en inserciones Transwell, las células no pueden polarizar en absoluto, o no puede polarizar completamente, tal como se define por una TEER ≥ 1000 Ω × ² cm y ≤ sodio 1% de fluoresceína de equilibrado colorante entre los compartimentos apical y basolateral. Además, Calu-3 células en LCC puede polarizar completamente, pero TEER pueden ser incompatibles entre mediciones. A pesar de las fluctuaciones en las mediciones TEER de Calu-3 LCC son normales en el día a día, una vez completamente polarizados, cambios dramáticos en TEER no se espera hasta que el cultivo disminuye naturalmente con la edad, que puede ser tan poco como 5 semanas o hasta semanas 12 después de la siembra.

La capacidad de Calu-3 LCC para polarizar depende en parte de cómo las células se mantienen y se subcultivaron antes de su uso en el sistema Transwell. Las células que han crecido más allá de 90% de confluencia como una monocapa durante el subcultivo, que han sido subcultivadas más de 10 veces de stock congelado, o que no han seren suministrada con medio fresco en un horario regular son menos propensos a polarizar completamente, y cualquier polarización es probable que disminuya rápidamente. Incompleta o falta total de polarización también se puede atribuir a la variación en el material y el tamaño de poro de transwells utilizados para Calu-3 LCC, y de lote a lote variación en transwells de composición similar y tamaño del poro puede afectar también a la polarización. Aumentar tamaños de poro puede permitir Calu-3 a crecer a través de la membrana Transwell en el compartimento basolateral, la prevención de la cultura de polarización. Una ausencia de polarización también puede ser debido al crecimiento bacteriano, se indica por medio de cultivo turbio, que conduce a la posterior ruptura de las uniones estrechas entre las células Calu-3.

Medidas variables TEER de Calu-3 LCC puede ser causada por alteraciones mecánicas de las monocapas de células Calu-3 LCC, inserciones, o las propias placas. Cambios en el medio y las mediciones TEER deberán realizarse sin puntas de pipeta o electroconduce de tocar las células. Durante la realización de estas operaciones, se debe tener cuidado para evitar la introducción de burbujas de aire en los compartimentos apical y basolateral, que interrumpen la capacidad de la voltohmmeter para detectar la resistencia. La capacidad de la voltohmmeter para detectar la resistencia en una cultura que es en realidad polarizada puede también limitada por la acumulación de proteínas en los conductores de los electrodos. Esta acumulación puede ser retirado con lijado suave, o puede ser corregida mediante la sustitución del electrodo.

Una vez Calu-3 LCC completamente polarizar y la TEER está aumentando ya no, Calu-3 LCC están listos para su uso como un modelo in vitro para la caracterización de las respuestas del huésped epiteliales de pulmón de células a la infección respiratoria. Este sistema permite una mejor caracterización de las respuestas de dirección a los patógenos en comparación con monocapa de cultivo de pulmón de células líneas tradicionalmente utilizados para estudiar patógenos respiratorios, tales como A549 y células HEp-2, con las ventajas adicionales de Calu-3 bei LCCng más rápida a desarrollar, se obtiene más fácilmente, y menos costoso para generar a primaria, y NHBE polarizado y diferenciado. Al igual que NHBE, polarizado Calu-3 demuestran la formación de uniones estrechas, y producen mucinas. Sin embargo, a diferencia de NHBE, polarizadas Calu-3 células no se diferencian en capas de células basales y de células epiteliales columnares ciliadas, y pocos polarizadas 3 Calu-células se desarrollan como cilios-proyecciones ^19. Así, aunque útil para examinar las respuestas polarizadas de las vías respiratorias células epiteliales respiratorias insulto, polarizado Calu-3 LCC no son un modelo ideal para estudiar el desarrollo de las vías respiratorias o remodelación en respuesta al insulto respiratorias o lesiones. Producción de moco por las células cultivadas in vitro pueden afectar la infectividad celular, así como la liberación de virus infeccioso y la propagación del virus en un modelo polarizado, y una comparación directa de la producción de moco entre polarizada Calu-3 LCC y NHBE polarizado y diferenciado no ha sido reportado . A549 y células HEp-2 avolver más fáciles de cultivar que Calu-3 células, sin embargo, a diferencia de Calu-3 LCC, no formar cultivos polarizados cuando se cultivan en insertos Transwell, y por lo tanto no son modelos ideales para el examen in vitro de las respuestas de las células epiteliales polarizadas a la infección por virus respiratorio .

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
			REACTIVOS
Calu-3	ATCC	HTB-55
0,05% de tripsina - EDTA al 0,02%	Gibco / Invitrogen	25300
Medio esencial mínimo de Eagle (EMEM)	Gibco / Invitrogen	07-00100DK
Suero fetal bovino (FBS)	HyClone	SH30070.03	Inactivan por calor, 56 º C, 30 minutos
No esenciales aminoácidos 100X (10 mM)	Gibco / Invitrogen	11140	Almacenar a 4 ° C en la oscuridad
L-glutamina	Gibco / Invitrogen	25030
HEPES	Gibco / Invitrogen	15630
FBS EMEM-10% (EMEM-10%)			Suplemento EMEM con FBS inactivado por calor al 10% de suero, esterilizada por filtro
EMEM-20% de FBS + suplementos (EMEM-20% + S)			Suplemento EMEM a concentraciones finales: FBS inactivado por calor, 20%; 1X aminoácidos; 2 mM L-glutamina; 10 mM de HEPES; estéril-filtro
24-así placas Transwell	Corning Costar	3472	3 micras de tamaño de poro, poliéster
Trypan azul	Gibco / Invitrogen	15250
Etanol	Sigma	E7023	Prepare un 70% utilizando estéril dH 2 O
PBS de Dulbecco (D-PBS)	Invitrogen	14040
No fluorescente tampón			118 mM NaCl;4,75 mM KCl, 2,53 mM CaCl 2 × H 2 O; 2,44 mM MgSO 4, 1,19 mM KH 2 PO 4, 25 mM NaHCO 3 en agua estéril, estéril filtro
Fluoresceína sódica	Sigma	6377	1 mg / ml en agua estéril no fluorescente tampón; estéril-filtro, proteger de la luz; almacenar a 4 º C hasta 6 meses
			EQUIPO
Voltohmmeter	World Precision Instruments
Stx2 electrodo	World Precision Instruments
Lector de placas ELISA			Capaz de medir un 486 o 490 A