* Ces auteurs ont contribué à parts égales
Les analyses d’ADN environnemental nécessitent une conception, des tests, une optimisation et une validation rigoureux avant que la collecte de données sur le terrain puisse commencer. Ici, nous présentons un protocole pour emmener les utilisateurs à travers chaque étape de la conception d’une espèce spécifique, basée sur la sonde qPCR analyse pour la détection et la quantification d’un ADN d’espèces cibles à partir d’échantillons environnementaux.
De nouvelles méthodes non invasives de détection et de surveillance de la présence d’espèces sont en cours d’élaboration pour aider à la gestion des pêches et de la conservation de la faune. L’utilisation d’échantillons d’ADN environnemental (ADN électronique) pour détecter le macrobiote est l’une de ces méthodes qui devient rapidement populaire et qui est mise en œuvre dans les programmes nationaux de gestion. Ici, nous nous concentrons sur le développement d’analyses ciblées spécifiques aux espèces pour les applications quantitatives pcr (qPCR) basées sur des sondes. L’utilisation de qPCR à base de sonde offre une plus grande spécificité que ce qui est possible avec les amorces seules. En outre, la capacité de quantifier la quantité d’ADN dans un échantillon peut être utile dans notre compréhension de l’écologie de l’ADN électronique et de l’interprétation des modèles de détection de l’ADN électronique sur le terrain. Un examen attentif est nécessaire dans l’élaboration et l’essai de ces essais afin d’assurer la sensibilité et la spécificité de la détection des espèces cibles à partir d’un échantillon environnemental. Dans ce protocole, nous délimités les étapes nécessaires à la conception et à l’essai d’analyses basées sur des sondes pour la détection d’une espèce cible; y compris la création de bases de données de séquences, la conception d’analyses, la sélection et l’optimisation des analyses, les performances d’analyse des tests et la validation sur le terrain. Suivre ces étapes aidera à réaliser un test efficace, sensible et spécifique qui peut être utilisé en toute confiance. Nous démontrons ce processus avec notre essai conçu pour les populations de la boue (Actinonaias ligamentina), une espèce de moules d’eau douce trouvée dans la rivière Clinch, Etats-Unis.
Les chercheurs et les gestionnaires s’intéressent de plus en plus à l’utilisation d’analyses d’ADN environnementale pour la détection des espèces. Depuis trois décennies, le PCR quantitatif ou en temps réel (qPCR/rtPCR) est utilisé dans de nombreux domaines pour la détection et la quantification spécifiques à la séquence des acides nucléiques1,2. Dans le domaine relativement nouveau de la recherche sur l’ADN, l’utilisation de ces essais avec une courbe standard pour la quantification des copies de l’ADN cible par volume ou poids de l’échantillon d’ADN est maintenant devenue une pratique courante. Les séquences d’ADN mitochondrial sont généralement ciblées dans les analyses d’ADN électronique parce que le génome mitochondrial est présent en milliers d’exemplaires par cellule, mais des analyses pour les séquences d’ADN nucléaire ou d’ARN sont également possibles. Il est essentiel de comprendre que les analyses publiées pour les échantillons d’ADN électronique ne sont pas toujours égales en termes de performances. La fiabilité d’un essai dans la détection de l’ADN d’une espèce cible (c.-à-d. la spécificité) et la détection de faibles quantités d’ADN cible (c.-à-d. sensibilité) peuvent varier considérablement en raison de différences dans la façon dont l’essai a été conçu, sélectionné, optimisé et testé. Les mesures quantitatives de déclaration des performances d’essai ont été largement négligées auparavant, mais récemment, des normes visant à améliorer la transparence dans le développement des analyses émergent3,4,5,6,7,8.
Optimisation et rapports des aides à la performance d’analyse dans la conception et l’interprétation des résultats de l’enquête eDNA. Les analyses qui réagissent croiséement avec l’ADN des espèces non cibles pourraient mener à de fausses détections positives, tandis que les analyses avec une faible sensibilité peuvent ne pas détecter l’ADN des espèces cibles même lorsqu’il est présent dans l’échantillon (faux négatifs). Une compréhension de la sensibilité et de la sélectivité des analyses aidera à éclairer l’effort d’échantillonnage nécessaire pour détecter les espèces rares. Étant donné qu’il existe de nombreuses sources naturelles de variation dans l’ADN, les études doivent limiter autant que possible les sources contrôlables de variation, y compris l’optimisation et la caractérisation complètes de l’analyseeDNA 3.
Les conditions qui affectent directement la spécificité ou la sensibilité d’un essai modifieront les performances de l’essai. Cela peut se produire dans différentes conditions de laboratoire (c.-à-d. différents reagents, utilisateurs, machines, etc.). Par conséquent, ce protocole devrait être revu lors de l’application d’un essai dans de nouvelles conditions. Même les essais bien caractérisés dans la littérature devraient être testés et optimisés lorsqu’ils sont adoptés par un nouveau laboratoire ou lors de l’utilisation de différents réacgages (p. ex., solution master-mix)5,9. La spécificité de l’analyse peut changer lorsqu’elle est appliquée à une région géographique différente, parce que l’analyse est appliquée à des échantillons provenant d’une nouvelle communauté biotique qui peuvent inclure des espèces non cibles contre qui l’essai n’a pas été testé, et des variations génétiques dans les espèces cibles peuvent se produire. Encore une fois, l’analyse devrait être réévaluée lorsqu’elle est utilisée dans un nouvel emplacement. Les conditions sur le terrain diffèrent des conditions de laboratoire parce que sur le terrain, les inhibiteurs du PCR sont plus susceptibles d’être présents dans les échantillons. Les inhibiteurs du PCR affectent directement la réaction d’amplification et affectent ainsi les performances de l’analyse. Pour cette raison, un contrôle positif interne est nécessaire lors de l’élaboration d’un essai eDNA.
Enfin, les conditions environnementales sur le terrain peuvent affecter les molécules d’ADN de l’espèce cible et leur capture par la dégradation, le transport et la rétention de l’ADN. De plus, les différents protocoles de collecte et d’extraction de l’ADN varient en fonction de leur efficacité et de leur capacité à conserver l’ADN. Cependant, il est important de noter que ces processus affectent la détectabilité de l’ADN, mais pas la performance d’un test moléculaire. Ainsi, la détection de l’ADN des espèces cibles dans les échantillons de champ est fonction à la fois de la performance technique de l’essai qPCR ainsi que des conditions sur le terrain et des protocoles de collecte, d’entreposage et d’extraction. Lors de l’utilisation d’un essai bien caractérisé et très performant, les utilisateurs peuvent se sentir confiants dans les capacités de l’essai; permettre aux chercheurs de se concentrer maintenant sur la compréhension des facteurs externes d’analyse (c.-à-d. les variables environnementales, les différences dans les protocoles de capture ou d’extraction) affectant la détection de l’ADN.
Ici, nous nous concentrons spécifiquement sur l’analyse des performances techniques grâce à une conception rigoureuse et l’optimisation. Nous démontrons le protocole à l’aide d’un test à base de sonde développé pour la détection d’une moule d’eau douce, le mucket (Actinonaias ligamentina), à partir de l’eau échantillonnée dans la rivière Clinch, Etats-Unis. Récemment, Thalinger et coll. (2020) ont présenté des lignes directrices pour la validation des essais ciblés de l’ADN. La conception d’essai suivant notre protocole apportera un essai au niveau 4 de Thalinger et autres plus une étape supplémentaire vers le niveau 56. À ce stade, les performances techniques d’un essai seront optimisées et il sera prêt pour une utilisation régulière dans les applications de laboratoire et de terrain. Une utilisation plus approfondie de l’analyse en laboratoire, en mésocosme et sur le terrain peut alors répondre aux questions concernant la détection de l’ADN et les facteurs influençant la détectabilité, les dernières étapes de la validation de niveau 56.
1. Génération d’une base de données de séquences de séquences d’ADN mitochondriales provenant d’espèces cibles et non cibles d’intérêt
2. Conception d’essai
3. Analyse de dépistage et d’optimisation
Lors de la conception d’un essai qPCR spécifique à chaque espèce pour le mucket (A. ligamentina), des séquences disponibles de toutes les espèces d’Unionidae dans la rivière Clinch ont été téléchargées. Des espèces étroitement apparentées comme Lampsilis siliquoidea ont également été incluses dans la base de données de référence, même si elles ne se trouvent pas dans la même rivière. Toutes les espèces du réseau fluvial d’intérêt n’ont pas été trouvées à GenBank, de sorte que d’autres espèces ont été séquencées dans la maison. Les séquences ont été alignées à l’aide du logiciel Geneious et le logiciel Primer Quest (IDT) a été utilisé pour concevoir plusieurs analyses. Cinq ensembles d’amorce et de sonde ont été ajoutés à l’alignement pour l’évaluationvisuelle ( figure 2). Ils ont ensuite été testés en silico à l’aide de Primer-Blast, après quoi ils ont été commandés pour d’autres tests in vitro. En laboratoire, tous les essais ont été testés à l’aide d’extractions d’ADN de 27 espèces disponibles pour vérifier la spécificité. Un essai (A.lig.1) n’a réussi à amplifier que l’espèce cible (tableau 1; Tableau 2). Cet essai a avancé pour d’autres essais de l’efficacité d’essai, LOD et LOQ. Il a une longueur amplicon de 121 paires de base. Le tableau 3 montre la séquence utilisée pour la norme a. ligamentina d’ADN synthétique. La figure 3A et la figure 3B montrent les résultats d’un essai réussi avec une bonne efficacité et des valeurs r2. La figure 3C et la figure 3D montrent un test dont la courbe standard a une faible efficacité; cet essai a été jeté. Le LOD et loq pour l’essai choisi (A.lig.1) se sont tous deux révélés être 5.00 copies/réaction utilisant la méthode discrète décrite dans Klymus et autres5. Le CIP qui a été multiplexé avec l’essai (tableaux 3-6) n’a pas affecté la courbe standard de l’essai de A. ligamentina. L’IPC que nous utilisons est un fragment de la transcription hemt souris. Cet essai a été préconceptionné par IDT pour une autre application, mais nous avons modifié son utilisation en tant qu’IPC pour les applications eDNA de notre laboratoire.
Une exécution qPCR réussie devrait répondre à certains critères pour chaque mesure de performance (c.-à-d. amplification standard de courbe, contrôle positif de l’ADN génomique, aucun contrôle de modèle et contrôle positif interne). Les normes d’analyse cible devraient avoir des courbes d’amplification exponentielles. Ces courbes devraient atteindre un plateau de point final si elles sont autorisées à exécuter suffisamment de cycles. Ceci indique que la sonde fluorescente est complètement consommée pendant la réaction, et les niveaux de fluorescence atteignant une limite maximale. Les normes d’amplification ultérieures peuvent ne pas atteindre un plateau en 40 cycles. Les contrôles positifs (ADN génomique et CIP) devraient avoir le même modèle. Les inconnues peuvent ou non amplifier, mais l’amplification en inconnus devrait également avoir un modèle exponentiel et un plateau de points de terminaison (figure 5).
Dans un qPCR de qualité, les dilutions standard s’amplifient à Cq uniformément espacé d’environ tous les cycles de 3,3 pour chaque différence de concentration de 10 fois. Chaque réplique d’une dilution standard amplifie d’une manière étroitement groupée ayant presque le même Cq (représenté par les valeurs r2). Toutes les dilutions standard s’exposent à l’amplification( Figure 3A). Dans un qPCR pauvre, les normes peuvent présenter une forme non exponentielle, une variation inégale des valeurs cq entre les dilutions, ne pas arriver à un plateau de point de terminaison, ou certaines dilutions peuvent ne pas amplifier du tout (Figure 3D).
Les paramètres importants pour une courbe standard sont l’efficacité, r2,pente, et y-intercept. L’efficacité devrait tomber entre 90%-110% avec des valeurs idéales proches de 100% et r2 valeurs devraient être au-dessus de 0,98 avec des résultats idéaux approchant 1,015,22. Les valeurs de pente devraient se situer entre -3,2 et -3,5 avec des résultats idéaux proches de -3,322. Les valeurs y-intercept devraient tomber entre un Cq de 34-41 avec des résultats idéaux ayant un Cq de 37,0. L’interception y est le Cq prévu d’une réaction avec 1 copie de la séquence cible, la plus petite unité qui peut être mesurée en un seul qPCR. Les inconnues avec Cq plus grand que l’interception y sont susceptibles d’être inhibées. L’exécution de plus de 40 cycles de PCR peut être nécessaire pour détecter la cible en cas d’inhibition ou d’un ensemble d’amorce inefficace, mais la quantification n’est pas possible dans ces circonstances et des contrôles négatifs supplémentaires sans la séquence cible, mais contenant l’ADN total semblable aux inconnus, devraient être exécutés pour exclure l’amplification des sources non spécifiques.
L’amplification du contrôle positif interne (CIP) dans des échantillons inconnus doit être comparée aux résultats du CIP de contrôle de modèle négatif, car il n’y a pas de concurrence pour les réa évaluateurs et aucun inhibiteur n’est présent. Les inconnues avec un CIP ayant un Cq de 2 cycles ou supérieure à la valeur moyenne cq du CNT, ou qui n’amplifient pas devraient être considérées comme inhibées. Si aucun inhibiteur n’est présent dans les échantillons, alors toute amplification iPC devrait avoir un regroupement serré dans la parcelle avec des valeurs Cq proches de la même que le CNT (Figure 6).
Enfin, des tests in situ de l’essai ont eu lieu. Vingt échantillons d’eau de la rivière Clinch et trois échantillons vierges ont été filtrés entre le 25 et le 26 septembre 2019 à moins de 500 mètres d’un lit de moule connu pour avoir A. ligamentina. Environ quatre échantillons d’eau de 1 L ont été filtrés par lieu d’échantillonnage. Sites d’emplacement inclus au fond du lit de moules dans le ruisseau, au fond du lit de moules près du rivage, à 100 m en aval du lit dans le ruisseau, à 500 m en aval du lit dans le ruisseau et à 500 m en aval du lit près de la rive (figure 7). De retour en laboratoire, chaque filtre a été coupé en deux et l’ADN n’a été extrait que de la moitié d’un filtre. Le reste de la moitié du filtre pour chaque échantillon a été conservé dans un congélateur de -80 °C. Des échantillons ont ensuite été exécutés à l’aide du multiplexé d’analyse A.lig.1 avec le CIP. Sur les 23 échantillons, cinq se sont révélés inhibés. Ces échantillons ont été dilués 1:10 et les dilutions ont été réédgées. Dix-neuf des 20 échantillons sur le terrain amplifiés à l’aide de l’analyse conçue. De ces 19 échantillons, cinq étaient au-dessus du LOD de l’essai et du LOQ de 5 copies/réaction ; ce qui signifie que la plupart des échantillons avaient une détection de l’AND, mais à un niveau où de faux résultats négatifs sont susceptibles de se produire et que l’analyse ne pouvait pas quantifier avec confiance le numéro de copie de ces 14 échantillons. Néanmoins, 75 à 100 % des quatre sites biologiques se répliquent amplifiés à chaque lieu d’échantillonnage. Deux des trois blancs de champ étaient négatifs, tandis qu’un vide de champ a montré l’amplification, soulignant l’importance de la technique propre dans le domaine.
Figure 1 : Flux de travail pour la construction de bases de données de séquences d’ADN mitochondriales. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Alignements de séquences pour les espèces de moules de rivière Clinch avec des amorces et des sondes prospectives pour l’analyse Actinonaias ligamentina ND1. Amorce avant en vert foncé, sonde en rouge et amorce inversée en vert clair. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Exemples de courbe standard et de régression linéaire. Unexemple d’une courbe standard acceptable dérivée de l’amplification de trois répliques chacune des six dilutions standard. Une série de dilution standard 10 fois avec la plus forte concentration de la norme sur la gauche, avec des concentrations décroissantes se déplaçant vers la droite. La ligne horizontale franchissant toutes les traces est le seuil de cycle à la quantitation (Cq). Là où chaque trace franchit ce seuil, c’est là que le Cq est déterminé. B. Régression linéaire faite à partir des répliques standard de la figure 3A. Les répliques des dilutions standard sont tracées en cercles et les inconnues (échantillons) sont tracées avec des x. L’efficacité est de 98,9%, r2 approchant 1,0, et la pente de -3,349. C. Exemple d’une courbe standard médiocre dérivée de l’amplification de trois répliques chacune des six dilutions standard. D. Une régression linéaire formant la courbe standard pour les répliques standard amplifiées dans l’exemple 3C. Notez la faible efficacité et les valeurs r2. Notez également que seulement 4 des 6 normes amplifiées. Si après les répétitions, la courbe standard ne s’améliore pas, le problème peut être avec un ensemble d’amorce/sonde pauvre qui n’amplifie pas l’ADN cible comme prévu dans ce cas, cet essai ne devrait pas être considéré. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4 : Exemples de configurations de plaques pour les courses QPCR standard LOD et LOQ. Les normes utilisées dans la courbe sont en bleu, la concentration standard diminue de bleu foncé à bleu clair. Contrôle positif de l’ADN en vert et aucun contrôle de modèle (CNT) en jaune. Concentrations standard expérimentales en gris montrant 24 répliques pour chaque dilution standard. La série de dilution a été plaquée sur deux plaques (A, B), chacune avec une courbe standard, un contrôle positif et un CNT. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 5 : Traces de configuration et d’amplification de la plaque d’une course qPCR. Uneconfiguration de plaque. , normes montrées en bleu, couleur plus foncée indiquant la plus haute concentration de la norme. Contrôle positif de l’ADN en vert, pas de contrôles de modèle en jaune (CNT), cibles d’échantillon en gris. B. Amplification des traces d’une course qPCR. Normes indiquées en bleu, contrôle positif de l’ADN en vert, aucun contrôle de modèle en jaune, et inconnus en rouge. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 6 : Traces d’amplification pour le contrôle positif interne (CIP). Traces iPC pour tous les échantillons inconnus en magenta et le CIP à partir des contrôles sans modèle (CNT) montrés en orange avec des triangles. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 7 : Carte montrant les sites de collecte eDNA d’un lit de moules dans la rivière Clinch le long de la frontière entre la Virginie et le Tennessee. Des échantillons ont été prélevés à Wallens Bend, au fond du lit, à 100 m en aval du lit et à 500 m en aval du lit. Les sites ont été recueillis au milieu du cours d’eau (en cours d’eau) ou à environ 1 à 2 mètres du rivage (rivage). S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
composant | nom | Séquence 5' – 3' | Étiquette fluorescente | |
Amorce avant | A.lig.1-f | CCCTCATCACGTACCTCTTAATC | ||
Amorce inversée | A.lig.1-r | GGAATGCCCATAATTCCAACTTTA GGAATGCCCATAATTCCAACTTTA | ||
sonde | Sonde A.lig.1 | TTCTTGAACGTAAAGCCCTCGGGT TTCTTGAACGTAAAGCCCTCGGGT TTCTTGAACGTAAAGCCCTCGGGT TTC | Fam |
Tableau 1 : Essai qPCR actinonaias ligamentina conçu (A.lig.1), y compris des séquences pour les amorces avant et arrière et la sonde.
espèce | amplifié | Dans la rivière Clinch |
1. Actinonaias ligamentina | oui | oui |
2. Actinonaias pectorosa | Non | oui |
3. Plicata Amblema | Non | oui |
4. Corbicula spp. | Non | oui |
5. Cumberlandia monodonta | Non | oui |
6. Cyclonaias tuberculata | Non | oui |
7. Stegaria Cyprogenia | Non | oui |
8. Elliptio dilatata | Non | oui |
9. Brevidens Epioblasma | Non | oui |
10. Epioblasma capsaeformis | Non | oui |
11. Epioblasma florentina aureola | Non | oui |
12. Epioblasma triquetra | Non | oui |
13. Cor Fusconaia | Non | oui |
14. Subrotunda Fusconaia | Non | oui |
15. Lampsilis ovata | Non | oui |
16. Lampsilis siliquoidea | Non | Non |
17. Lasmigona costata | Non | oui |
18. Rimosus lemiox | Non | oui |
19. Dolabelloides Lexingtonia | Non | oui |
20. Conradicus Medionidus | Non | oui |
21. Plethobasus cyphyus | Non | oui |
22. Plénum pleurobema | Non | oui |
23. Fasciolaris Ptychobranchus | Non | oui |
24. Ptychobranchus sous-ténor | Non | oui |
25. Pustulosa Quadrula | Non | oui |
26. Strophitus undulatus | Non | oui |
27. Iris de Villosa | Non | oui |
Tableau 2 : Liste des espèces utilisées pour le test de spécificité in vitro de l’essai A.lig.1. L’analyse a amplifié l’ADN génomique de la cible (Actinonaias ligamentina) et n’a pas amplifié l’une des espèces non cibles.
composant | Séquence 5'-3' | ||||
Actinonaias ligementina standard | CCCTCATCACGTAC (en) CTCTTAATCCTATTAGGTGTCGCATTTTTCACTCTTCTTGAACGTA | ||||
AAGCCCTCGGGT ACTTTCAAATCCGAAAAGGCCCAAATAAAGTTGGAATTATGGGCATTC ACTTTCAAATCCGAAAAGGCC CAAATAAAGTTGGAATTATGGGCATTC ACTTTCAAATCCAAAGGGGGGGGCCAAAAAGGGGCCAAAGGCC CAAATA | |||||
CCCAACCATTAGCAGATGCTCTAAAGCTCTTCGTAAAAGAATGAGTAACACCAACCTCCT | |||||
CAAACTACCTACCCTTCATCTTAACCCCAACCACTATGTTATTATTAGCACTTAGACTTT | |||||
GACAATTATTTCCATCCTTTATANTATCATCCCAAATANTTTTTGGTATGCTCCTATTCT | |||||
TGTGTATCTCCTCCCTAGCTGTTTATATAACACTTATAACAGGCTGAGCCTCAAACTCCA | |||||
AATATGCCCTTTTAGGAGCTATTCGAGCCATAGCCCAAACCATTTCTTATGAGGTTACAA | |||||
TAAC (TAAC) | |||||
Modèle IPC (Hem-T) | CTACATAAGTAACACCTTCTCATGTCCAAAGCTCTCTGAGTGTCCCTCGAATCTCAGACGCT | ||||
GTATGACAGTCTCCTTGTGTGAACATTCGGCTCTATGTTCTCAAGGACTGCAC | |||||
Tableau 3 : Séquence (5'-3') de la norme Actinonaias ligamentina et du modèle IPC (Hem-T) utilisé pour cet essai. La séquence des amorces avant et arrière est en gras et italique, et celle de la sonde est soulignée.
composant | nom | Séquence 5' – 3' | Étiquette fluorescente | |
Amorce avant | HemT-F | TCTGAGTGTCCCTCGAATCT | ||
Amorce inversée | HemT-R | GCAGTCCTTGAGAACATAGAGC | ||
sonde | HemT-P | TGACAGTCTCCTTGTGTGAACATTCG | Cy5 (en) |
Tableau 4 : L’analyse du contrôle positif interne (CIP), y compris les séquences pour les amorces avant et arrière et la sonde.
Volume par échantillon (μL) | composant |
10 | Mix Maître de l’environnement |
1 | 20uM A. lig.1 F/R mix |
1 | Sonde 2.5uM A. lig.1 |
1 | Mélange d’amorce IPC 5uM (HemT-F/ R) |
0.75 | Sonde IPC de 2,5 uM (HemT-P) |
1.5 | 1 X 103 concentration du modèle IPC |
2.75 | H20 |
2 | échantillon |
20 | Total Volume |
Tableau 5 : Le mélange PCR utilisé pour le multiplex d’analyse A.lig.1 avec l’essai IPC.
pas | Température (°C ) | Heure | |
1 | Dénoature initiale | 95 | 10 min |
2 | dénaturer | 95 | 15 sec |
3 | recuit | 60 | 1 min |
4 | Passez à l’étape 2, répétez 39X |
Tableau 6 : Conditions de réaction pour l’analyse A.lig.1.
Comme pour toute étude, la définition de la question à traiter est la première étape et la conception de l’analyse eDNA dépend de la portée de l’étude26. Par exemple, si le but de la recherche ou de l’enquête est de détecter une ou quelques espèces, un test ciblé basé sur une sonde est le meilleur. Toutefois, si l’objectif est d’évaluer une suite plus grande ou un assemblage d’espèces, les analyses de métabarcoding de séquençage à haut débit sont mieux adaptées. Une fois qu’il est déterminé quelle approche prendre, une étude pilote comprenant la conception, les essais et l’optimisation des analyses est recommandée.24. La conception des analyses commence par une liste d’espèces décrites dans Figure 1. Cette liste sera à la base pour comprendre comment un test fonctionne en termes de spécificité et de l’étendue géographique à qui il pourrait être appliqué6,10. Il est encouragé à concevoir l’essai d’une zone géographique spécifique, permettant au concepteur de mieux tester un essai de réactivité croisée contre d’autres espèces dans cette région, et d’être conscient des limites que cela a sur l’extension d’un essai à d’autres zones où une espèce cible peut se produire24. Une fois la liste terminée, les séquences peuvent être téléchargées à partir de bases de données génétiques publiques. Étant donné que ces bases de données sont incomplètes27, il faut séquencer autant d’espèces sur la liste que possible à l’interne pour compléter la base de données de référence locale des séquences qui seront utilisées dans la conception d’analyse. Priorisez les espèces étroitement apparentées, car ce sont les non-cibles les plus probables qui s’amplifieront. Se concentrer sur toutes les espèces du même genre ou de la même famille que l’espèce cible est un bon point de départ. Les comparaisons avec des espèces étroitement apparentées aideront à identifier les régions séquence uniques aux espèces cibles. Cela peut aider à informer comment l’analyse peut effectuer dans d’autres systèmes ou emplacements. Les régions mitochondriales sont le choix habituel pour le développement d’analyse, parce que plus d’informations de séquence d’une plus grande variété d’espèces sont disponibles aux gènes mitochondriques qui ont été utilisés dans le code à barres des projets de vie, et parce que l’ADN mitochondrique est présent à une concentration beaucoup plus grande dans les copies/cellule que l’ADN nucléaire24,28,29. Plusieurs régions génétiques devraient être évaluées pour le développement ultérieur de l’analyse, car la couverture des séquences varie d’un taxa à l’autre dans les bases de données des référentiels génétiques. Une fois cette base de données locale de séquences de référence créée, une combinaison de visualisation manuelle des données de séquence alignées et des logiciels informatiques est utilisée pour concevoir les analyses d’amorce/sonde. Il ne faut pas se fier strictement au logiciel pour déterminer quels essais tester. Il est important de vérifier visuellement sur les alignements où les amorces et les sondes sont assises sur les cibles et les non-cibles pour mieux comprendre comment elles pourraient agir dans un PCR. Enfin, le dépistage et l’optimisation des analyses comprennent trois niveaux (in silico, in vitro et in situ)6,7,24,25. Dans la conception et les tests silico sont importants pour produire une courte liste d’essais avec de bonnes chances de succès, mais empirique (in vitro) test est crucial pour choisir l’essai avec les meilleures performances réelles. L’optimisation in vitro et l’essai des essais comprennent la mesure de l’efficacité de la réaction et la définition de la sensibilité et de la spécificité de l’essai. Les limites de détection et de quantification sont deux paramètres souvent négligés dans le développement d’analyses, mais importants pour l’interprétation des données. En exécutant plusieurs répliques des courbes standard pour un essai, LOD et LOQ peuvent facilement être mesurés1,5,30. Peu d’études discutent des résultats en ce qui concerne le LOD ou loq de l’essai, mais Sengupta et coll. (2019) intègrent le LOD et le LOQ de leur analyse dans leur interprétation des données et leurs graphiques pour une meilleure compréhension de leurs résultats.31. Les contrôles positifs internes doivent également être multiplexés dans l’analyse conçue. Sans test d’inhibition de la PCR dans les échantillons, de faux négatifs peuvent se produire24,32. Nous proposons l’utilisation d’un essai multiplexé d’IPC avec l’essai cible comme méthode la plus facile pour l’essai d’inhibition de PCR23. Enfin, des essais in situ de l’essai à partir d’échantillons prélevés sur le terrain et en laboratoire sont nécessaires pour s’assurer que l’amplification cible se produit dans les échantillons environnementaux.24.
Il existe des limites à l’utilisation d’analyses qPCR spécifiques aux espèces et basées sur des sondes avec des échantillons d’ADN. Par exemple, la conception de plusieurs essais pour les tests peut être limitée par la disponibilité de la séquence, et des compromis peuvent être nécessaires sur certains aspects des performances d’analyse. Ces choix doivent être guidés par les objectifs de l’étude et doivent être rapportés avec les résultats26. Par exemple, si l’objectif est la détection d’une espèce rare et que peu de points positifs sont attendus, un essai avec une spécificité imparfaite (c.-à-d. l’amplification d’espèces non cibles) pourrait être utilisé si toutes les détections étaient vérifiées par séquençage. Si l’objectif est de surveiller l’aire de répartition géographique d’une espèce et que les données sur la concentration de l’ADN sont pas nécessaires, un essai avec une efficacité imparfaite pourrait être utilisé et les données ne seraient déclarées qu’en pourcentage de détection. En outre, à moins que tous les conspécifiques potentiels ne soient testés en laboratoire, ce qui est rarement possible, on ne peut pas connaître avec une certitude absolue la véritable spécificité d’un essai. Par exemple, l’essai a été conçu et testé contre plusieurs espèces de moules d’eau douce dans la rivière Clinch. Pour utiliser cet essai dans un système fluvial différent, nous aurions besoin de le tester contre une suite d’espèces dans le nouvel emplacement. Les variations génétiques au sein de l’espèce ou de la population qui ne sont pas testées lors du développement de l’analyse peuvent également affecter la spécificité. Enfin, même si un essai a été vérifié pour avoir des performances techniques élevées; les conditions changent lorsque vous travaillez sur le terrain. Les conditions non liées à l’analyse telles que le débit d’eau, le pH et le comportement des animaux peuvent modifier la détectabilité de l’ADNE, tout comme l’utilisation de différents protocoles de collecte et d’extraction de l’ADN. L’utilisation d’analyses optimisées et bien décrites facilitera la compréhension de l’influence de ces paramètres sur la détection de l’ADN.
Le domaine de l’ADN est en train de mûrir au-delà du stade de l’analyse exploratoire pour accroître la normalisation des méthodes et des techniques. Ces développements amélioreront notre compréhension des techniques, des capacités et des limitations de l’ADN électronique. Le processus d’optimisation que nous décrivons ci-dessus améliore la sensibilité, la spécificité et la reproductibilité d’un essai. Le but ultime de ce raffinement et de cette normalisation des méthodes eDNA est d’améliorer les capacités des chercheurs à faire des inférences basées sur les données de l’ADN électronique ainsi que d’accroître la confiance des utilisateurs finaux et des détenteurs de pieu dans les résultats.
Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts. Les commanditaires du financement n’ont joué aucun rôle dans la conception de l’étude; dans la collecte, les analyses ou l’interprétation des données; dans l’écriture du manuscrit; ou dans la décision de publier les résultats.
Nous remercions Alvi Wadud et Trudi Frost qui ont aidé au développement et aux essais d’amorçage. Le financement de la conception de l’essai rapporté dans cette étude a été fourni par le Programme stratégique de recherche et de développement environnementaux du ministère de la Défense (RC19-1156). Toute utilisation de noms commerciaux, de produits ou d’entreprises est à des fins descriptives seulement et n’implique pas l’approbation par le gouvernement des États-Unis. Les données générées au cours de cette étude sont disponibles sous forme de communiqué de données de l’USGS https://doi.org/10.5066/P9BIGOS5.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
96 Place Reversible Racks with Covers | Globe Scientific | 456355AST | |
Clean gloves (ie. latex, nitrile, etc.) | Kimberly-Clark | 43431, 55090 | |
CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System | Bio-Rad | 1855196 | |
Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 1.5mL | Fisher Scientific | 5408129 | |
Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 2.0mL | Fisher Scientific | 2681332 | |
Hard-Shell 96-Well PCR Plates, low profile, thin wall, skirted, white/clear | Bio-Rad | #HSP9601 | |
IPC forward and reverse primers | Integrated DNA Technologies, Inc. | none | custom product |
IPC PrimeTime qPCR Probes | Integrated DNA Technologies, Inc. | none | custom product |
IPC Ultramer DNA Oligo synthetic template | Integrated DNA Technologies, Inc. | none | custom product |
Labnet MPS 1000 Compact Mini Plate Spinner Centrifuge for PCR Plates | Labnet | C1000 | |
Microcentrifuge machine | Various | - | Any microcentrifuge machine that hold 1.5mL and 2.0mL tubes is typically okay. |
Microseal 'B' PCR Plate Sealing Film, adhesive, optical | Bio-Rad | MSB1001 | |
Nuclease-Free Water (not DEPC-Treated) | Invitrogen | AM9932 | |
Pipette Tips GP LTS 1000 µL F 768A/8 | Rainin | 30389272 | |
Pipette Tips GP LTS 20 µL F 960A/10 | Rainin | 30389274 | |
Pipette Tips GP LTS 200 µL F 960A/10 | Rainin | 30389276 | |
Pipettes | Rainin | Various | Depending on lab preference, manual or electronic pipettes can be used at various maximum volumes. |
TaqMan Environmental Master Mix 2.0 | Thermo Fisher Scientific | 4396838 | |
Target forward and reverse primers | Integrated DNA Technologies, Inc. | none | custom product |
Target PrimeTime qPCR Probes | Integrated DNA Technologies, Inc. | none | custom product |
Target synthetic gBlock gene fragment | Integrated DNA Technologies, Inc. | none | custom product. used for qPCR standard dilution series |
TE Buffer | Invitrogen | AM9849 | |
VORTEX-GENIE 2 VORTEX MIXER | Fisher Scientific | 50728002 |
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