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  • Discussion
  • Déclarations de divulgation
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  • matériels
  • Références
  • Réimpressions et Autorisations

Résumé

Les nanoparticules lipidiques sont développées à l’aide d’une approche de plate-forme de mélange microfluidique pour l’encapsulation de l’ARNm et de l’ADN.

Résumé

Les transporteurs de médicaments à base de lipides ont été utilisés pour les systèmes d’administration cliniquement et commercialement disponibles en raison de leur petite taille, de leur biocompatibilité et de leur grande efficacité d’encapsulation. L’utilisation de nanoparticules lipidiques (LNPs) pour encapsuler les acides nucléiques est avantageuse pour protéger l’ARN ou l’ADN de la dégradation, tout en favorisant l’absorption cellulaire. Les LLP contiennent souvent plusieurs composants lipidiques, y compris un lipide ionisable, un lipide d’aide, du cholestérol et un lipide conjugué en polyéthylène glycol (PEG). Les LNPs peuvent facilement encapsuler les acides nucléiques en raison de la présence de lipides ionisables, qui, à faible pH, est cationique et permet une complexation avec de l’ARN ou de l’ADN chargé négativement. Ici, les LNPs sont formés en encapsulant l’ARN messager (ARNm) ou l’ADN plasmidique (ADNp) en mélangeant rapidement les composants lipidiques dans une phase organique et le composant acide nucléique dans une phase aqueuse. Ce mélange est effectué à l’aide d’une plate-forme de mélange microfluidique précise, permettant l’auto-assemblage des nanoparticules tout en maintenant le flux laminaire. La taille hydrodynamique et la polydispersité sont mesurées à l’aide de la diffusion dynamique de la lumière (DLS). La charge de surface effective sur le LNP est déterminée en mesurant le potentiel zêta. L’efficacité d’encapsulation est caractérisée à l’aide d’un colorant fluorescent pour quantifier l’acide nucléique piégé. Des résultats représentatifs démontrent la reproductibilité de cette méthode et l’influence des différents paramètres de formulation et de procédé sur les LNP développés.

Introduction

Les transporteurs de médicaments sont utilisés pour protéger et délivrer un traitement aux propriétés favorables typiques, notamment une faible cytotoxicité, une biodisponibilité accrue et une stabilité améliorée1,2,3. Les nanoparticules polymères, les micelles et les particules à base de lipides ont déjà été explorées pour l’encapsulation et la livraison d’acides nucléiques4,5,6,7. Les lipides ont été utilisés dans différents types de systèmes de nanotransporteurs, y compris les liposomes, et les nanoparticules lipidiques, car ils sont biocompatibles avec une grande stabilité8. Les LNPs peuvent facilement encapsuler les acides nucléiques pour l’administration de gènes9,10. Ils protègent l’acide nucléique de la dégradation par les protéases sériques au cours de la circulation systémique11 et peuvent améliorer l’administration à des sites spécifiques, car la topographie de surface et les propriétés physiques des LNP influencent leur biodistribution12. Les LLP améliorent également la pénétration tissulaire et l’absorption cellulaire9. Des études antérieures ont démontré le succès de l’encapsulation du siRNA dans un LNP13, y compris le premier LNP disponible dans le commerce contenant du siRNA thérapeutique pour le traitement de la polyneuropathie du traitement héréditaire de l’amylose héréditaire médiée par la transthyrétine14 qui a été approuvé par la Food and Drug Administration (FDA) des États-Unis et l’Agence européenne des médicaments en 2018. Plus récemment, les LNP sont à l’étude pour l’administration de fractions d’acides nucléiques plus importantes, à savoir l’ARNm et l’ADN9. En 2018, il y avait ~ 22 systèmes d’administration d’acides nucléiques à base de lipides en cours d’essais cliniques14. De plus, les ARNm contenant des LLP sont actuellement les principaux candidats et ont été utilisés pour un vaccin contre laCOVID-19 15,16. Le succès potentiel de ces thérapies géniques non virales nécessite la formation de petites particules (~ 100 nm), stables et uniformes avec une encapsulation élevée de l’acide nucléique.

L’utilisation d’un lipide ionisable comme composant principal dans la formulation LNP a montré des avantages pour la complexation, l’encapsulation et l’efficacité de l’administration14. Les lipides ionisables ont généralement une constante de dissociation acide (pKa) < 7; par exemple, le dilinoleylméthyl-4-diméthylaminobutyrate (D-Lin-MC3-DMA), le lipide ionisable utilisé dans la formulation LNP approuvée par la FDA, a un pKa de 6,4417. À faible pH, les groupes amines sur le lipide ionisable deviennent protonés et chargés positivement, ce qui permet l’assemblage avec des groupes phosphate chargés négativement sur l’ARNm et l’ADN. Le rapport des groupes amine, « N », aux groupes phosphate, « P », est utilisé pour optimiser l’assemblage. Le rapport N/P dépend des lipides et des acides nucléiques utilisés, qui varie en fonction de la formulation18. Après la formation, le pH peut être ajusté à un pH neutre ou physiologique pour permettre l’administration thérapeutique. À ces valeurs de pH, le lipide ionisable est également déprotoné, ce qui confère une charge de surface neutre au LNP.

Le lipide ionisable aide également à l’évasion endosomale19,20. Les LNP subissent une endocytose pendant l’absorption cellulaire et doivent être libérés de l’endosome afin de délivrer la cargaison d’ARNm dans le cytoplasme cellulaire ou la cargaison d’ADN au noyau21. À l’intérieur de l’endosome se trouve généralement un environnement plus acide que le milieu extracellulaire, ce qui rend le lipide ionisable chargé positivement22,23. Le lipide ionisable chargé positivement peut interagir avec des charges négatives sur la membrane lipidique endosomale, ce qui peut provoquer une déstabilisation de l’endosome permettant la libération du LNP et de l’acide nucléique. Différents lipides ionisables sont actuellement à l’étude pour améliorer l’efficacité de la distribution de la LNP, ainsi que de l’échappement endosomale14.

D’autres composants typiques d’un LNP comprennent les lipides d’aide, tels qu’un lipide de phosphatidylcholine (PC) ou de phosphoéthanolamine (PE). La 1,2-dioléoyl-sn-glycéro-3-phosphoéthanolamine (DOPE), la 1,2-distéaroyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPC) et la 1,2-dioléoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) sont des lipides d’aide couramment utilisés24,25. Il a été démontré que le DOPE forme une phase HEXAGONALE II inversée (HII) et améliore la transfection par fusion membranaire26,tandis que le DSPC a été pensé pour stabiliser les LNP avec sa géométrie cylindrique27. Le cholestérol est également incorporé dans la formulation afin d’augmenter la rigidité de la membrane, aidant ainsi à la stabilité du LNP. Enfin, le polyéthylène glycol conjugué aux lipides (PEG) est inclus dans la formulation pour fournir la barrière stérique nécessaire pour aider à l’auto-assemblage des particules27. Peg améliore également la stabilité de stockage des LNPs en empêchant l’agrégation. De plus, le PEG est souvent utilisé comme composant furtif et peut augmenter le temps de circulation des LLP. Cependant, cet attribut peut également poser des défis pour le recrutement des LNP en hépatocytes par le biais d’un mécanisme de ciblage endogène piloté par l’apolipoprotéine E (ApoE)28. Ainsi, des études ont étudié la longueur de la chaîne acyle pour la diffusion du PEG à partir du LNP, constatant que les longueurs courtes (C8-14) se dissocient du LNP et se prêtent mieux au recrutement d’ApoE par rapport aux longueurs d’acyle plus longues28. De plus, il a été démontré que le degré de saturation de la queue lipidique à laquelle le PEG est conjugué influence la distribution tissulaire des LLP29. Récemment, Tween 20, qui est un tensioactif couramment utilisé dans les formulations de produits pharmaceutiques biologiques et a une longue queue lipidique insaturée, s’est avéré avoir une transfection élevée dans les ganglions lymphatiques drainants par rapport au PEG-DSPE, qui transfectait en grande partie le muscle au site d’injection29. Ce paramètre peut être optimisé pour obtenir la biodistribution LNP souhaitée.

Les méthodes conventionnelles de formation de LNPs comprennent la méthode d’hydratation en couche mince et la méthode d’injectiond’éthanol 27. Bien qu’il s’agit de techniques facilement disponibles, elles exigent également beaucoup de main-d’œuvre, peuvent entraîner une faible efficacité d’encapsulation et sont difficiles à mettre à l’échelle27. Les progrès dans les techniques de mélange ont abouti à des méthodes plus faciles à mettre à l’échelle, tout en développant des particules plus uniformes27. Ces méthodes comprennent le mélange de jonction en T, le mélange à chevrons décalé et la focalisation hydrodynamique microfluidique27. Chaque méthode a une structure unique, mais toutes permettent de mélanger rapidement une phase aqueuse contenant l’acide nucléique avec une phase organique contenant les composants lipidiques, ce qui entraîne une encapsulation élevée de l’acide nucléique27. Dans ce protocole, un mélange rapide et contrôlé à travers une cartouche microfluidique est utilisé, qui utilise la conception de mélange à chevrons décalé. Ce protocole décrit la préparation, l’assemblage et la caractérisation des acides nucléiques contenant des LLP.

Protocole

Un schéma de l’ensemble du processus est fourni à la figure 1.

1. Préparation des tampons

REMARQUE: Le filtrage stérile des tampons est fortement suggéré ici pour éliminer toutes les particules qui peuvent avoir un impact sur la qualité de l’acide nucléique et du LNP.

  1. Solution saline tamponnée au phosphate (PBS)
    1. Préparer 1x PBS en utilisant 8 mM Na2HPO4,2 mM KH2PO4, 137 mM NaCl et 2,7 mM KCl dans de l’eau sans nucléase et ajuster le pH à 7,4.
    2. Stériliser par filtration sous vide à l’aide d’un filtre de 0,22 μm de la taille d’un pore.
  2. Tampon de citrate
    1. Préparer un tampon de citrate en utilisant 5 mM de citrate de sodium, 5 mM d’acide citrique et 150 mM de chlorure de sodium dans de l’eau sans nucléase et ajuster à un pH de 4,5.
    2. Stériliser par filtration sous vide à l’aide d’un filtre de 0,22 μm de la taille d’un pore.
      REMARQUE: Le tampon de citrate ne doit être préparé que si l’ARNm est l’acide nucléique qui sera encapsulé dans le LNP. Si l’ADN doit être encapsulé, sautez 1.2 et passez à 1.3.
  3. Tampon d’acide malique
    1. Préparer un tampon d’acide malique en utilisant 20 mM d’acide malique et 30 mM de chlorure de sodium dans de l’eau sans nucléase et ajuster à un pH de 3,0.
    2. Stériliser par filtration sous vide à l’aide d’un filtre de 0,22 μm de la taille d’un pore.
      REMARQUE: Le tampon d’acide malique ne doit être préparé que si l’ADN est l’acide nucléique qui sera encapsulé dans le LNP. Sautez 1,3 si l’ARNm doit être encapsulé. Le tampon de citrate est utilisé pour l’encapsulation de l’ARNm, car le pH inférieur de 3,0 avec le tampon d’acide malique peut entraîner une probabilité accrue de dégradation de l’ARNm. Le protocole peut être mis en pause ici.

2. Préparation du mélange lipidique

  1. Si les lipides de base sont sous forme de poudre, solubiliser dans de l’éthanol pur à l’épreuve de 200.
  2. Calculez le mélange requis de composants lipidiques en fonction du rapport molaire souhaité. Un rapport molaire de 50:10:39:1 (lipide ionisable:lipide d’aide:cholestérol:PEG) sera utilisé ici comme exemple pour une concentration lipidique totale de 10 mM. Le tableau 1 montre les concentrations et les volumes nécessaires pour chacun de ces composants.
    REMARQUE: Lors du calcul du volume nécessaire pour atteindre la concentration du mélange lipidique dans l’éthanol (EtOH) pour le mélangeur microfluidique, le volume total est pris en compte pour s’assurer que l’ajout d’EtOH n’influence pas les concentrations lipidiques. Par exemple, un volume lipidique ionisable de 68,5 μL est calculé en multipliant la concentration de 5 mM dans l’éthanol par un volume total de mélange lipidique de 533 μL, puis en divisant par la concentration lipidique mère de 38,9 mM.
  3. Ajouter la quantité appropriée de chaque solution lipidique dans un flacon en verre pour permettre aux composants de se mélanger avec un vortex intermittent. Ajouter 200 éthanol d’épreuve pour un mélange total de 533 μL. Pour l’exemple du tableau 1,il s’agit de 254 μL d’éthanol.
    REMARQUE: Pour une seule série pour produire 1 mL de LLP, 342,5 μL de solution lipidique sont nécessaires. Cela est dû à un mélange 3:1 d’acide nucléique aqueux à une solution lipidique organique avec un certain volume jeté avant et après le prélèvement de l’échantillon. Un mélange de 533 μL est fait pour compenser l’utilisation excessive.

3. Préparation de la solution d’acide nucléique

REMARQUE: La préparation et la manipulation des solutions d’acides nucléiques doivent être effectuées dans un environnement stérile et exempt de RNase dans la mesure du possible. Travaillez dans une armoire de biosécurité chaque fois que possible avec l’acide nucléique.

  1. Calculer le rapport N/P. Le rapport N/P est le nombre total de groupes lipides amines ionisables (N) par rapport au nombre total de groupes phosphates d’acides nucléiques (P) chargés négativement. Le rapport N/P est souvent un paramètre qui peut être optimisé lors de la formation de LNP. Suivez les étapes ci-dessous.
    1. Calculez le nombre de N unités à l’aide de la formule ci-dessous :
      figure-protocol-4474
      REMARQUE: La concentration de lipides ionisables (Tableau 1) est de 5 mM, ce qui équivaut à 5 x 10-6 mol / mL. Le volume d’injection lipidique requis est de 0,3425 mL. Par exemple, si le nombre de N unités par molécule est de 1, en utilisant l’équation ci-dessus, il y a 1,03 x 1018 unités N dans le mélange lipidique.
    2. Calculez les unités P pour le rapport N/P souhaité. Ici, un N/P = 36 est utilisé par exemple.
      figure-protocol-5010
  2. Calculer la concentration d’acide nucléique nécessaire pour obtenir 2,86 x 1016 unités P en utilisant l’équation ci-dessous.
    figure-protocol-5240
    Où, le nombre d’unités P par paire de bases pour l’ARNm est de 1 et l’ADN est de 2. Pour un ARNm de 1 200 bases, la quantité d’ARNm requise pour un N/P = 36 est de 3,96 x 10à 11 moles.
  3. Calculer la concentration massique d’ARNm requise pour N/P = 36 en utilisant l’équation ci-dessous.
    figure-protocol-5619
    Le poids moléculaire moyen d’une unité monophosphate de ribonucléotide est de 322 g/mol30. Avec un ARNm de 1 200 bases, le poids moléculaire de l’ARNm est de 386 400 g/mol. Le volume d’injection requis de solution d’acide nucléique est de 1,028 mL. Ainsi, la concentration d’ARNm nécessaire est de 1,488x10-5 g/mL, soit 14,88 μg/mL.
  4. Constituer 1,5 mL de 14,88 μg/mL d’ARNm dans un tampon de citrate.
    REMARQUE: Lorsque l’ADN sera l’acide nucléique encapsulé, utilisez un tampon d’acide malique pour constituer la solution d’acide nucléique.

4. Amorçage des canaux microfluidiques

REMARQUE: Ce protocole est adapté des directives du fabricant de l’instrument.

  1. Entrez les paramètres d’amorçage dans le logiciel de l’instrument en cliquant sur les champs appropriés (Tableau 2).
    REMARQUE: Un rapport de débit de 3: 1 et un débit de 4-12 mL / min est recommandé27,31 . Cela s’est avéré optimal dans les études présentées ici, ainsi que par le fabricant. Cela peut être varié s’il est intéressant pour l’application.
  2. Ouvrez le couvercle de l’instrument et placez une cartouche microfluidique dans le bloc rotatif.
  3. Aspirer au moins 0,5 mL d’éthanol dans une seringue de 1 mL, en s’assurant qu’il n’y a pas de bulles ou d’espaces d’air à l’extrémité de la seringue. Chargez cette seringue dans l’entrée droite de la cartouche.
  4. Remplissez une seringue de 3 mL avec 1,5 mL de tampon aqueux (citrate pour l’ARN et acide malique pour l’ADN), en vous assurant qu’il n’y a pas de bulles d’air ou de trous. Chargez cette seringue dans l’entrée gauche de la cartouche.
  5. Insérez deux tubes coniques de 15 mL dans les porte-clips pour servir de conteneurs à déchets.
  6. Cliquez sur Exécuter dans le logiciel de l’instrument pour commencer le mixage, en vous assurant que les paramètres sont entrés correctement.
  7. Lorsque l’instrument cesse de s’amorcer, comme l’indique la lumière bleue inférieure qui s’éteint, ouvrez le couvercle et jetez correctement les tubes coniques et les seringues.

5. Formation de LNP

REMARQUE: Ce protocole est adapté des directives du fabricant de l’instrument.

  1. Mettez à jour le logiciel avec les paramètres de formulation en cliquant sur les champs appropriés (Tableau 2).
  2. Remplissez une seringue de 1 mL avec le mélange lipidique (préparé à l’étape 2). Retirez les trous d’air ou les bulles à l’extrémité de la seringue et insérez la seringue dans le côté droit de la cartouche.
  3. Aspirer la solution d’acide nucléique (préparée à l’étape 3) dans une seringue de 3 mL, en s’assurant qu’il n’y a pas de bulles ou d’espaces d’air dans l’embout de la seringue. Insérez la seringue dans l’entrée gauche de la cartouche.
    REMARQUE: Des volumes sont fournis pour faire une solution de 1 mL de LLP. Cet instrument peut incorporer des tailles de seringues allant jusqu’à 10 mL, et les volumes peuvent être mis à l’échelle en conséquence sans influence sur le résultat. Le volume maximal de LLP pouvant être préparés en une seule préparation est de 12 mL.
  4. Étiquetez un tube conique sans RNase de 15 mL avec le nom de l’échantillon et insérez-le dans le clip du tube gauche. Placez un déchet conique de 15 mL dans le clip de tube droit.
  5. Fermez le couvercle de l’instrument et cliquez sur Exécuter, après avoir confirmé la saisie correcte des paramètres.
  6. Une fois l’instrument fini de fonctionner, jetez correctement le conteneur à déchets et la cartouche. Conservez le tube conique avec l’échantillon LNP.
  7. Diluer le LNP 5x avec du PBS pour minimiser l’éthanol à <5% (v / v).
    REMARQUE: Il est important de diluer les LLP dans le PBS dès que possible après le mélange microfluidique pour éviter la dégradation. Effectuez toujours la dilution dans une armoire de biosécurité et continuez à travailler dans l’armoire de biosécurité tout au long des échanges de tampons.

6. Échange de tampon

REMARQUE: Le protocole d’utilisation des filtres ultra-centrifuges est fourni. Bien que cette méthode se traduise par un échange plus rapide de tampons, la dialyse peut être substituée ici.

  1. Prélavez un filtre ultra-centrifuge (taille de pore de 100 kDa) avec 2 mL de PBS par centrifugation à 1000 x g pendant 5 min. Videz le PBS du compartiment inférieur.
    REMARQUE: PBS est choisi pour augmenter le pH à 7,4 ± 0,2, ce qui est physiologiquement pertinent et entraînera une charge neutre du lipide ionisable.
  2. Ajouter les LLP dilués dans le compartiment supérieur du filtre ultra-centrifuge prélavé et centrifuger à 1000 x g pendant 12 min.
  3. Jetez le flux à travers le compartiment inférieur. Effectuez deux lavages supplémentaires en ajoutant 5 mL de PBS au filtre ultra-centrifuge à chaque fois. Centrifuger aux mêmes paramètres. Il n’y a pas de volume maximum à maintenir.
    REMARQUE : Si un volume de LLP à grande échelle a été préparé, augmentez le volume de PBS pour chaque lavage en conséquence. Par exemple, si 2 mL de LLP ont été préparés en une seule fois, alors 10 mL de PBS par lavage sont suggérés.
  4. Pipettez la solution LNP contre les parois du filtre ultra-centrifuge plusieurs fois pour minimiser la perte de LNP. Retirer la solution LNP du filtre ultracentrifique et la conserver dans un flacon sans nucléase. Ajouter PBS si nécessaire pour obtenir un volume final de la solution LNP de 1 mL.
  5. Filtrer à travers un filtre à seringue pré-humide de 0,2 μm, si nécessaire.
    REMARQUE: Le protocole peut être mis en pause ici.

7. Mesurer l’efficacité de l’encapsulation

  1. Préparer une courbe standard en effectuant des dilutions en série 2 fois de la solution d’acide nucléique de travail dans le PBS, en commençant par une concentration maximale de 500 ng / mL et en effectuant au moins cinq dilutions. Utilisez PBS comme vide.
  2. Préparer les dilutions de l’échantillon LNP. Diluer les échantillons de LNP avec du PBS, pour obtenir une concentration théorique approximative qui se situe autour du point médian de la courbe standard (par exemple, ~ 250 ng / mL d’acide nucléique estimé à partir de la concentration initiale).
  3. Préparer une solution du réactif de quantification de l’ARN (pour les mesures d’ARNm) avec TritonX-100 pour perturber les LNP et mesurer la quantité totale d’acide nucléique à l’intérieur et à l’extérieur du LNP. Cette solution contient 0,5 % (v/v) de réactif d’ARN, 0,4 % (v/v) de TritonX-100 et 99,1 % (v/v) de PBS.
  4. Préparer une solution du réactif sans TritonX-100 pour mesurer la quantité d’acide nucléique non encapsulée dans les LLP. Cette solution contient 0,5 % (v/v) de réactif d’ARN et 99,5 % (v/v) de PBS.
    REMARQUE: Si les LNP encapsulent de l’ADN double brin (dsDNA), tel que l’ADN plasmidique, utilisez plutôt le réactif dsDNA dans 7.3 et 7.4, en suivant la même procédure.
  5. Dans une plaque de fluorescence noire de 96 puits, chargez au moins quatre répliques de chacune des solutions étalons LNP et acide nucléique préparées aux points 7.1 et 7.2.
  6. À la moitié des répétitions d’étalons et d’échantillons, ajoutez un volume égal du réactif contenant TritonX-100. Cela permettra de quantifier la quantité totale d’acide nucléique.
  7. Aux puits restants d’étalons et d’échantillons, ajoutez un volume égal de réactif sans TritonX-100. Cela permettra de quantifier la quantité d’acide nucléique non encapsulée à l’intérieur du LNP.
  8. Agiter la plaque pendant 5 min à température ambiante pour assurer un mélange minutieux des étalons et des échantillons avec le réactif ajouté, en prenant des précautions pour éviter l’exposition à la lumière.
  9. Mesurez la fluorescence à l’aide d’un lecteur de microplaques, avec une longueur d’onde d’excitation de 480 nm et une longueur d’onde d’émission de 520 nm.
  10. Calculer la concentration d’acide nucléique en dehors du LNP en utilisant la courbe standard réalisée avec l’ajout du réactif sans TritonX-100. Multiplier par le facteur de dilution utilisé au 7.2.
  11. Calculer la concentration d’acide nucléique à l’intérieur et à l’extérieur du LNP en utilisant la courbe standard réalisée avec l’ajout du réactif contenant TritonX-100. Multiplier par le facteur de dilution utilisé au 7.2.
  12. Calculer la concentration d’acide nucléique à l’intérieur en soustrayant la concentration d’acide nucléique à l’extérieur (calculée à partir de l’étape 7.10) de la concentration totale d’acide nucléique à l’intérieur et à l’extérieur (calculée à partir de l’étape 7.11)
  13. Quantifier l’efficacité d’encapsulation à partir du rapport entre la concentration d’acide nucléique à l’intérieur du PNL (calculée à partir de l’étape 7.12) et la concentration totale d’acide nucléique (calculée à partir de l’étape 7.11).
    REMARQUE: Le protocole peut être mis en pause ici.

8. Ajustements de concentration

  1. Si nécessaire, ajustez la concentration d’acide nucléique dans la solution LNP en utilisant les résultats de l’efficacité d’encapsulation.
  2. Si une solution moins concentrée est souhaitée, diluer la solution avec du PBS pour obtenir la concentration souhaitée.
  3. Si une solution plus concentrée est souhaitée, effectuez des essais de centrifugation supplémentaires à l’aide d’un filtre ultra-centrifuge.
    REMARQUE: Le protocole peut être mis en pause ici.

9. Mesurer la taille hydrodynamique et la polydispersité du LNP

  1. Diluer une aliquote de la solution LNP 40x avec du PBS pour obtenir un volume final de 1 mL.
    REMARQUE: Cette dilution peut être modifiée si nécessaire. Cette valeur de dilution est suggérée car elle utilise un petit volume de la solution de stock LNP tout en fournissant des résultats de qualité.
  2. À l’aide d’une cuvette semi-micro, mesurez le diamètre hydrodynamique et l’indice de polydispersité. Ajouter la solution LNP dans la cuvette et insérer dans l’instrument. Configurez une procédure d’exploitation dans le logiciel de l’instrument pour inclure le type de mesure, les détails de l’échantillon (matériau, dispersant, température et type de cellule) et les instructions de mesure (nombre de séries). Cliquez sur Démarrer lorsque vous êtes prêt à commencer l’acquisition de mesure.

10. Mesurer le potentiel zêta LNP

  1. Diluer une aliquote de la solution LNP 40x avec de l’eau sans nucléase pour obtenir un volume final de 1 mL.
    REMARQUE: L’eau sans nucléase est utilisée comme solvant pour les mesures du potentiel zêta afin de minimiser l’influence des tampons salins élevés sur la conductivité.
  2. À l’aide d’une cellule zêta capillaire repliée, mesurez le potentiel zêta.
    1. Ajouter la solution LNP dans la cuvette jusqu’à la ligne de remplissage. Insérez dans l’instrument en vous assurant que les électrodes entrent en contact avec l’instrument.
    2. Configurez une procédure d’exploitation dans le logiciel de l’instrument pour inclure le type de mesure, les détails de l’échantillon (matériau, dispersant, température et type de cellule) et les instructions de mesure (nombre de séries). Cliquez sur Démarrer lorsque vous êtes prêt à commencer l’acquisition de mesure.

Résultats

Plusieurs lots de LNP avec la même formulation lipidique et le même rapport N/P de 6 ont été développés sur des jours distincts pour démontrer la reproductibilité de la technique. Les lots 1 et 2 ont entraîné des distributions de taille qui se chevauchent avec une polydispersité similaire (Figure 2A) Aucune différence significative n’a été observée dans la taille ou l’efficacité d’encapsulation entre les deux lots différents (

Discussion

La reproductibilité, la rapidité et le criblage à faible volume sont des avantages importants de l’utilisation du mélange microfluidique pour former des LLP par rapport à d’autres méthodes existantes (par exemple, l’hydratation du film lipidique et l’injection d’éthanol). Nous avons démontré la reproductibilité de cette méthode sans impact sur l’efficacité d’encapsulation ou la taille des particules observée avec différents lots LNP. Il s’agit d’un critère essentiel pour que tout traiteme...

Déclarations de divulgation

Tous les auteurs sont des employés de Sanofi. Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas de conflit d’intérêts ou d’intérêts financiers concurrents.

Remerciements

Merci à Atul Saluja, Yatin Gokarn, Maria-Teresa Peracchia, Walter Schwenger et Philip Zakas pour leurs conseils et leurs contributions au développement de LNP.

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
1,2-dimyristoyl-rac-glycero-3-methoxypolyethylene glycol-2000 (C-14 PEG)Avanti Polar Lipids880151P
10 µl Graduated Filter Tips  (RNase-,DNase-, DNA-free)USA Scientific1121-3810
1000 µl Graduated Filter Tips (RNase-,DNase-, DNA-free)USA Scientific1111-2831
20 µl Beveled Filter Tips (RNase-,DNase-, DNA-free)USA Scientific1120-1810
200 µl Graudated Filter Tips (RNase-,DNase-, DNA-free)USA Scientific1120-8810
3β-Hydroxy-5-cholestene, 5-Cholesten-3β-ol (Cholesterol)Sigma-AldrichC8667
BD Slip Tip Sterile Syringes (1 ml syringe)Thermo Fisher Scientific14-823-434
BD Slip Tip Sterile Syringes (3 ml syringe)Thermo Fisher Scientific14-823-436
BD Vacutainer General Use Syringe Needles (BD Blunt Fill Needle 18G)Thermo Fisher Scientific23-021-020
Benchtop CentrifugeBeckman coulter
Black 96 well platesThermo Fisher Scientific14-245-177
BrandTech BRAND BIO-CERT RNase-, DNase-, DNA-free microcentrifuge tubes (1.5mL)Thermo Fisher Scientific14-380-813
Citric AcidFisher Scientific02-002-611
Corning 500ml Vacuum Filter/Storage Bottle System, 0.22 um poreCorning430769
Disposable folded capillary cellsMalvernDTS1070
Ethyl Alcohol, Pure 200 proofSigma-Aldrich459844
Fisher Brand Semi-Micro CuvetteThermo Fisher Scientific14955127
Invitrogen Conical Tubes (15 mL) (DNase-RNase-free)Thermo Fisher ScientificAM12500
MilliporeSigma Amicon Ultra Centrifugal Filter UnitsThermo Fisher ScientificUFC901024
NanoAssemblr BenchtopPrecision Nanyosystems
Nuclease-free waterThermo Fisher ScientificAM9930
Phosphate Buffered Saline (PBS)Thermo Fisher ScientificAM9624
Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay KitThermo Fisher Scientific P7589
Quant-iT RiboGreen RNA Assay KitThermo Fisher ScientificR11490
Sodium ChlorideFisher Scientific02-004-036
Sodium Citrate, Dihydrate, granularFisher Scientific02-004-056
SpectraMax i3xMolecular Devices
Zetasizer NanoMalvern

Références

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