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摘要

脂质纳米粒子是使用微流体混合平台方法开发的，用于mRNA和DNA封装。

摘要

基于脂质的药物载体由于体积小、生物相容性和封装效率高，已用于临床和商业上可用的交付系统。使用脂质纳米粒子（LNPs）封装核酸有利于保护RNA或DNA免受降解，同时促进细胞吸收。LNPs 通常含有多种脂质成分，包括电离子脂、辅助脂质、胆固醇和聚乙烯乙二醇 （PEG） 结合脂质。LNPs 可以很容易地封装核酸，由于电离子脂质的存在，在低 pH 值是阴离子的，并允许与负电压 RNA 或 DNA 的复合。在这里，LNPs是通过封装信使RNA（mRNA）或质粒DNA（pDNA）形成的，使用有机相中的脂质成分和在声相中核酸成分的快速混合。这种混合使用精确的微流体混合平台进行，允许纳米粒子自组装，同时保持层流。水动力学大小和多散射是使用动态光散射 （DLS） 测量的。LNP 上的有效表面电荷通过测量 zeta 电位来确定。封装效率的特点是使用荧光染料来量化包裹的核酸。具有代表性的结果表明，该方法具有可重复性，并且不同的配方和工艺参数对已开发的 LNP 具有影响。

引言

药物携带者用于保护和提供具有典型有利特性的治疗，包括低细胞毒性，增加生物可用性，并改善稳定性1，2，3。聚合物纳米粒子、鼠类和脂质粒子以前曾被探索过核酸封装和输送4、5、6、7。脂质已用于不同类型的纳米载体系统，包括脂质体和脂质纳米粒子，因为它们与高稳定性8生物相容。LNPs可以很容易地封装核酸的基因传递9，10。它们保护核酸在系统循环过程中不受血清蛋白酶的降解，并可以改善对特定部位的输送，因为LNPs的表面地形和物理特性会影响其生物分布12。LNPs还改善组织渗透和细胞吸收9。先前的研究表明，在LNP13中，西RNA封装取得了成功，包括首个含有西RNA治疗遗传性转乙酰激素介质淀粉样体病的LNP治疗药物，该疗法于2018年获得美国食品和药物管理局（FDA）和欧洲药品管理局的批准。最近，正在研究LNPs的交付更大的核酸，即mRNA和DNA9。截至2018年，有+22个基于脂质的核酸输送系统正在进行临床试验14。此外，含有LNPs的mRNA目前是主要候选者，并已受雇于COVID-19疫苗15，16。这些非病毒基因疗法的潜在成功需要形成小（+100 nm），稳定和均匀的粒子与高核酸封装。

在LNP配方中使用电离子脂作为主要成分，在复合、封装和递送效率14方面显示出优势。离子脂质通常具有酸分离常数 （pKa） < 7:例如，二烯酰-4-二甲基丁基丁酸酯（D-Lin-MC3-DMA），在FDA批准的LNP配方中使用的电离子脂质，pKa为6.4417。在低pH值下，电离子脂质上的胺组变得质子化和正电荷，允许在mRNA和DNA上与负电荷磷酸盐组组装。胺、"N"、组与磷酸盐、"P"的比例，用于优化组件。N/P比率取决于使用的脂质和核酸，根据配方18而异。形成后，pH值可调整为中性或生理pH值，以便进行治疗管理。在这些 pH 值下，电离脂质也脱质，从而向 LNP 提供中性表面电荷。

电离子脂也有助于内分泌逃生19，20。LNPs在细胞吸收过程中接受内分泌，必须从内皮体中释放出来，以便将mRNA货物送入细胞质或DNA货物到细胞核21。内皮体内部通常比细胞外介质更酸性，使电离子脂质正电荷22，23。带正电荷的电离子脂质可与内分泌脂膜上的负电荷相互作用，从而导致内皮体不稳定，从而释放LNP和核酸。目前正在研究不同的电离子脂质，以提高LNP分布的功效，以及内分泌逃逸14。

LNP 的其他典型成分包括辅助脂质，如磷脂酰胆碱 （PC） 或磷乙醇胺 （PE） 脂质。1，2-二甲苯-sn-甘油-3-磷乙醇胺（多普），1，2-二乙酰-sn-甘油-3-磷 磷胆碱 （DSPC）， 和 1，2 二醇 - sn-甘油-3 磷胆碱 （DOPC） 是常用的辅助脂质24，25.DOPE已被证明形成一个倒置的六边形II（HII）相，并通过膜融合26增强透射，而DSPC已被认为稳定LNPs与圆柱形几何27。胆固醇也被纳入配方，以增加膜刚度，随后有助于LNP的稳定。最后，脂质结合聚乙烯乙二醇（PEG）被纳入配方，以提供必要的石碑屏障，以帮助在粒子自组装27。PEG 还通过防止聚合来提高 LNP 的存储稳定性。此外，PEG 经常被用作隐形组件，可以增加 LNP 的循环时间。然而，这一属性也可能构成挑战，招募LNPs肝细胞通过内源性定位机制驱动的阿波利波蛋白E（ApoE）28。因此，研究已经调查了从LNP扩散PEG的乙酰链长度，发现短长度（C8-14）与LNP分离，更适合ApoE招募相比，更长的乙酰长度28。此外，PEG 与之结合的脂质尾巴饱和程度已证明会影响 LNPs29的组织分布。最近，Tween 20，这是生物药物制剂中常用的表面活性剂，具有长期不饱和脂质的尾巴，与PEG-DSPE相比，在排出淋巴结方面具有很高的转化性，PEG-DSPE主要在注射部位29处对肌肉进行透射。此参数可以优化，以实现所需的 LNP 生物分布。

传统的LNP形成方法包括薄膜水化法和乙醇注射法27。虽然这些是现成的技术，他们也是劳动密集型的，可能会导致低封装效率，并具有挑战性地扩大27。混合技术的进步使得方法更易放大，同时开发出更均匀的粒子27。这些方法包括T结混合，交错鱼骨混合，微流体流体动力学聚焦27。每种方法都有独特的结构，但都允许快速混合含有核酸的一个液态与含有脂质成分的有机相，从而产生高封装的核酸27。在此协议中，利用通过微流体墨盒进行快速和可控的混合，采用交错的鱼骨混合设计。本协议概述了含有 LNPs 的核酸的制备、组装和定性。

研究方案

图1提供了整个过程的示意图。

1. 准备缓冲器

注意:这里强烈建议对缓冲器进行无菌过滤，以去除可能影响核酸和 LNP 质量的任何颗粒物。

  1. 磷酸盐缓冲盐水 （PBS）
    1. 使用 8 mM Na2HPO 4、2 mM KH2PO4、137 mM NaCl 和 2.7 mM KCl 在核酸酶无水中准备 1x PBS，并将 pH 值调整为 7.4。
    2. 使用 0.22 μm 孔径过滤器进行真空过滤消毒。
  2. 柠檬酸盐缓冲器
    1. 使用 5 mM 柠檬酸钠、5 mM 柠檬酸和 150 mM 氯化钠在无核酸水中准备柠檬酸盐缓冲器，并调整到 pH 4.5。
    2. 使用 0.22 μm 孔径过滤器进行真空过滤消毒。
      注:只有在 mRNA 是将封装在 LNP 中的核酸时，才需要准备柠檬酸盐缓冲器。如果DNA将被封装跳过1.2，并继续到1.3。
  3. 乳酸缓冲器
    1. 使用20mM乳酸和30mM氯化钠在无核酸水中准备乳酸缓冲器，并调整到pH3.0。
    2. 使用 0.22 μm 孔径过滤器进行真空过滤消毒。
      注:只有当DNA是将封装在LNP中的核酸时，才需要准备乳酸缓冲器。如果要封装 mRNA，请跳过 1.3。柠檬酸盐缓冲用于 mRNA 封装，因为带乳酸缓冲器的 3.0 的低 pH 值可能导致 mRNA 降解的可能性增加。协议可以在此处暂停。

2. 脂质混合物的制备

  1. 如果库存脂质为粉末状，则以纯 200 证明乙醇溶液。
  2. 根据所需的摩尔比率计算所需的脂质成分组合。50:10:39:1（离子脂质:辅助脂质:胆固醇:PEG）的摩尔比将在这里用作总脂质浓度为10mM的示例。 表 1 显示每个组件所需的浓度和体积。
    注:在计算微流体混合器乙醇 （EtOH） 中实现脂质混合浓度所需的体积时，会考虑总体积，以确保 EtOH 的添加不会影响脂质浓度。例如，通过将乙醇中的 5 mM 浓度乘以 533 μL 的总脂质混合体积，然后除以 38.9 mM 的库存脂质浓度来计算 68.5 μL 的电离子脂质体积。
  3. 将每个脂质库存溶液的适当数量添加到玻璃瓶中，使组件与间歇性涡流混合。加入200种证明乙醇，总混合物为533微升。例如，表 1，这是254微升乙醇。
    注:要单次运行以生产 1 mL 的 LNPs，需要 342.5 μL 的脂质溶液。这是由于3:1混合了液态核酸到有机脂溶液，在样品收集前后丢弃了一些体积。混合 533 μL 以补偿超标。

3. 核酸溶液的制备

注:核酸溶液的准备和处理将在无菌和无砷的环境中尽可能进行。尽可能用核酸在生物安全柜中工作。

  1. 计算市盈率。N/P 比率是可电离子脂胺组 （N） 与负电压核酸磷酸盐组 （P） 的总数。N/P 比率通常是在 LNP 形成期间可以优化的参数。按照下面的步骤操作。
    1. 使用以下公式计算 N 单位的数量:
      figure-protocol-1626
      注:电离子脂质浓度（表1）为5mM，相当于5×10-6摩尔/mL。所需的脂质注射量为 0.3425 mL。例如，如果每个分子的 N 单位数为 1，则使用上述方程，脂质混合物中有 1.03 x10 18 N 单位。
    2. 计算所需 N/P 比率的 P 单位。例如，这里使用了 N/P = 36。
      figure-protocol-1893
  2. 使用以下方程计算必要的核酸浓度，以获得 2.86 x10 16 P 单位。
    figure-protocol-2036
    其中，mRNA 每碱基对的 P 单位数为 1，DNA 为 2。对于具有 1，200 个碱基的 mRNA，N/P = 36 所需的 mRNA 量为 3.96 x 10-11 摩尔。
  3. 使用以下方程计算 N/P = 36 所需的 mRNA 质量浓度。
    figure-protocol-2253
    核糖核苷酸单磷酸盐单位的平均分子量为322克/摩尔30。mRNA的分子量为1，200基mRNA，分子量为386，400克/摩尔。核酸溶液所需的注射量为 1.028 mL。因此，所需的 mRNA 浓度为 1.488x10-5 g/mL，即 14.88 μg/mL。
  4. 在柠檬酸盐缓冲区中，组成 1.5 mL 的 14.88 μg/mL 的 mRNA。
    注:当DNA将核酸封装时，使用乳酸缓冲剂来组成核酸溶液。

4. 启动微流体通道

注:此协议根据仪器制造商的准则进行修改。

  1. 单击相应的字段（表 2）将启动参数输入到仪器软件中。
    注:建议流量比为3:1，流量为4-12 mL/min。。。这已被证明是最好的研究在这里提出，以及制造商。如果对申请感兴趣，情况可能会有所不同。
  2. 打开仪表盖，将微流体墨盒放入旋转块中。
  3. 将至少 0.5 mL 的乙醇抽入 1 mL 注射器中，确保注射器尖端没有气泡或空气间隙。将此注射器加载到墨盒的右入口。
  4. 用1.5兆L的排液缓冲器填充3mL注射器（RNA的柠檬酸盐和DNA的乳酸），确保没有气泡或间隙。将此注射器加载到墨盒的左入口。
  5. 在夹子支架中插入两个 15 mL 圆锥形管，用作废容器。
  6. 单击" 运行" 仪器软件开始混合，确保参数输入正确。
  7. 当仪器停止启动时，由底部蓝光关闭指示，打开盖子并正确处理锥形管和注射器。

5. LNP 编队

注:此协议根据仪器制造商的准则进行修改。

  1. 点击相应的字段（表2），用配方参数更新软件。
  2. 将 1 mL 注射器与脂质混合物一起填充（在第 2 步中准备）。去除注射器尖端的任何气隙或气泡，并将注射器插入墨盒的右侧。
  3. 将核酸溶液（在第 3 步中准备）绘制到 3 mL 注射器中，确保注射器尖端没有气泡或气隙。将注射器插入墨盒的左入口。
    注:提供卷，使LNPs的1ml解决方案。该仪器可以集成高达 10 mL 的注射器尺寸，并且体积可以相应地缩放，不会对结果造成影响。一次制备中可制备的 LNP 的最大容量为 12 mL。
  4. 将一个 15 mL 无 RNase 的锥形管标记为样本名称，并插入到左管夹中。将 15 mL 废圆锥体放在右管夹中。
  5. 在确认参数的正确输入后，关闭仪表盖并单击 "运行"。
  6. 仪器运行完后，正确丢弃废容器和墨盒。保留带有 LNP 样品的圆锥管。
  7. 用 PBS 稀释 LNP 5x，将乙醇降至 <5% （v/v）。
    注:在微流体混合后，尽快稀释PBS中的LNPs，以防止降解，这一点很重要。始终在生物安全柜中执行稀释，并在整个缓冲交换期间继续在生物安全柜中工作。

6. 缓冲交换

注:提供使用超离心机过滤器的协议。虽然此方法可更及时高效地交换缓冲器，但透析可以在此处替代。

  1. 通过 1000 x g 的离心机离心，预洗 2 mL PBS 的超离心机过滤器（100 kDa 孔径大小），持续 5 分钟。从底部隔间清空 PBS。
    注:选择PBS将pH值提高到7.4±0.2，这在生理上是相关的，将导致电离子脂具有中性电荷。
  2. 将稀释的 LNPs 添加到预洗超离心机滤清器的顶舱中，以 1000 x g 为离心机，持续 12 分钟。
  3. 丢弃从底部隔间流过的流量。每次在超离心机滤清器中加入 5 mL 的 PBS，再进行两次清洗。以相同的参数离心。没有需要保持的最大音量。
    注:如果准备了放大的 LNP 体积，则相应地增加每次洗涤的 PBS 体积。例如，如果单次运行时准备了 2 mL 的 LNPs，则建议每次洗涤 10 mL PBS。
  4. 将 LNP 解决方案对超离心机滤光片的墙壁进行几次，以最大限度地减少 LNP 损失。从超离心机过滤器中取出 LNP 溶液并存放在无核素小瓶中。如果需要，添加 PBS 以实现 1 mL 的 LNP 解决方案的最终体积。
  5. 如有必要，通过预湿的 0.2 μm 注射器过滤器进行过滤。
    注:协议可以在此处暂停。

7. 测量封装效率

  1. 通过在 PBS 中对工作核酸溶液进行 2 倍串序稀释，从最高浓度 500 ng/mL 开始，并至少进行 5 次稀释，从而准备标准曲线。将 PBS 用作空白。
  2. 准备 LNP 样品稀释。用 PBS 稀释 LNP 样品，以实现围绕标准曲线中点的大致理论浓度（例如，从初始浓度估计的 250 ng/mL 核酸）。
  3. 准备使用 TritonX-100 的 RNA 定量试剂（用于 mRNA 测量）的解决方案，以破坏 LNPs 并测量 LNP 内外的核酸总量。此解决方案包含 0.5% （v/v） RNA 试剂、0.4% （v/v） TritonX-100 和 99.1% （v/v） PBS。
  4. 准备一个没有 TritonX-100 的试剂溶液，以测量 LNPs 中未封装的核酸量。此解决方案包含 0.5% （v/v） RNA 试剂和 99.5% （v/v） PBS。
    注:如果 LNPs 封装双搁浅 DNA （dsDNA），如质粒 DNA，则按照相同的程序在 7.3 和 7.4 中使用 dsDNA 试剂。
  5. 在 96 井黑色荧光板中，装载至少四个复制的 LNP 和核酸标准溶液，分别以 7.1 和 7.2 表示。
  6. 在标准和样品的复制品中，增加一个包含 TritonX-100 的试剂的等量。这将量化核酸的总量。
  7. 在剩余的标准和样品井中，添加具有 TritonX-100 的同等数量的试剂。这将量化LNP中未封装的核酸量。
  8. 在室温下摇动板5分钟，确保将标准和样品与添加的试剂彻底混合，采取预防措施避免光线照射。
  9. 使用微板读取器测量荧光，激发波长为 480 nm，发射波长为 520 nm。
  10. 使用添加没有 TritonX-100 的试剂所制定的标准曲线计算 LNP 以外的核酸浓度。乘以 7.2 中使用的稀释因子。
  11. 使用添加含有 TritonX-100 的试剂所制定的标准曲线计算 LNP 内外核酸的浓度。乘以 7.2 中使用的稀释因子。
  12. 通过从内外核酸的总浓度中减去核酸的浓度（从第7.10步计算），计算核酸内部的浓度（从第7.11步计算）
  13. 从LNP内核酸浓度（从第7.12步计算）和核酸总浓度（从第7.11步计算）中量化封装效率。
    注:协议可以在此处暂停。

8. 浓度调整

  1. 如有必要，使用封装效率的结果调整 LNP 溶液中的核酸浓度。
  2. 如果需要不太集中的解决方案，则用 PBS 稀释溶液以实现所需的浓度。
  3. 如果需要更集中的解决方案，则使用超离心机过滤器进行额外的离心运行。
    注:协议可以在此处暂停。

9. 测量LNP流体动力大小和多分散性

  1. 将 LNP 解决方案的引文稀释 40 倍，与 PBS 配合在一起，以获得 1 mL 的最终体积。
    注意:如果需要，可能会更改此稀释。建议此稀释值，因为它使用少量的 LNP 库存解决方案，同时提供质量结果。
  2. 使用半微微晶圈，测量流体动力直径和多分散度指数。将 LNP 解决方案添加到库维特并插入仪器中。在仪器软件中设置操作程序，包括测量类型、样品详细信息（材料、分散剂、温度和细胞类型）和测量说明（运行次数）。当准备开始测量采集时，单击 "开始 "。

10. 衡量LNP泽塔潜力

  1. 用无核酸酶水稀释 LNP 溶液 40 倍的酸液，以获得 1 mL 的最终体积。
    注:无核酸酶水用作zeta潜在测量的溶剂，以尽量减少高盐缓冲对电导率的影响。
  2. 使用折叠毛细细的泽塔细胞，测量泽塔的潜力。
    1. 将 LNP 解决方案添加到填充线的库维特中。插入仪器，确保电极与仪器接触。
    2. 在仪器软件中设置操作程序，包括测量类型、样品详细信息（材料、分散剂、温度和细胞类型）和测量说明（运行次数）。当准备开始测量采集时，单击 "开始 "。

结果

在不同的天开发了多批具有相同脂质配方和6的NPP，以证明该技术的可重复性。第1批和第2批导致大小分布重叠，具有类似的多散（图2A），在两个不同批次之间的大小或封装效率方面没有显著差异（图2B）。每批封装效率高（>98.5%），尺寸与77纳米LNP直径相似。颗粒均匀，第 1 批的平均多分散度指数 （PDI） 为 0.15，第 2 批的平均...

讨论

与其他现有方法（如脂膜水化和乙醇注射）相比，可重复性、速度和低体积筛选是使用微流体混合形成 LNP 的重要优势。我们已经证明了这种方法的可重复性，对用不同的LNP批次观察到的封装效率或颗粒大小没有影响。这是任何治疗，包括LNPs，成为临床可用的基本标准。

这里描述的技术采用交错的鱼骨微流体混合，这导致LNP形成的时间尺度只有几分钟。这种混合使用混沌的?...

披露声明

所有作者都是萨诺菲的员工。作者宣称他们没有利益冲突或相互竞争的经济利益。

致谢

感谢阿图尔·萨卢贾、亚廷·戈卡恩、玛丽亚-特雷莎·佩拉基亚、沃尔特·施文格和菲利普·扎卡斯对LNP发展的指导和贡献。

材料

NameCompanyCatalog NumberComments
1,2-dimyristoyl-rac-glycero-3-methoxypolyethylene glycol-2000 (C-14 PEG)Avanti Polar Lipids880151P
10 µl Graduated Filter Tips  (RNase-,DNase-, DNA-free)USA Scientific1121-3810
1000 µl Graduated Filter Tips (RNase-,DNase-, DNA-free)USA Scientific1111-2831
20 µl Beveled Filter Tips (RNase-,DNase-, DNA-free)USA Scientific1120-1810
200 µl Graudated Filter Tips (RNase-,DNase-, DNA-free)USA Scientific1120-8810
3β-Hydroxy-5-cholestene, 5-Cholesten-3β-ol (Cholesterol)Sigma-AldrichC8667
BD Slip Tip Sterile Syringes (1 ml syringe)Thermo Fisher Scientific14-823-434
BD Slip Tip Sterile Syringes (3 ml syringe)Thermo Fisher Scientific14-823-436
BD Vacutainer General Use Syringe Needles (BD Blunt Fill Needle 18G)Thermo Fisher Scientific23-021-020
Benchtop CentrifugeBeckman coulter
Black 96 well platesThermo Fisher Scientific14-245-177
BrandTech BRAND BIO-CERT RNase-, DNase-, DNA-free microcentrifuge tubes (1.5mL)Thermo Fisher Scientific14-380-813
Citric AcidFisher Scientific02-002-611
Corning 500ml Vacuum Filter/Storage Bottle System, 0.22 um poreCorning430769
Disposable folded capillary cellsMalvernDTS1070
Ethyl Alcohol, Pure 200 proofSigma-Aldrich459844
Fisher Brand Semi-Micro CuvetteThermo Fisher Scientific14955127
Invitrogen Conical Tubes (15 mL) (DNase-RNase-free)Thermo Fisher ScientificAM12500
MilliporeSigma Amicon Ultra Centrifugal Filter UnitsThermo Fisher ScientificUFC901024
NanoAssemblr BenchtopPrecision Nanyosystems
Nuclease-free waterThermo Fisher ScientificAM9930
Phosphate Buffered Saline (PBS)Thermo Fisher ScientificAM9624
Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay KitThermo Fisher Scientific P7589
Quant-iT RiboGreen RNA Assay KitThermo Fisher ScientificR11490
Sodium ChlorideFisher Scientific02-004-036
Sodium Citrate, Dihydrate, granularFisher Scientific02-004-056
SpectraMax i3xMolecular Devices
Zetasizer NanoMalvern

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