Formulando e caracterizando nanopartículas lipídicas para entrega de genes usando uma plataforma de mistura microfluida

Resumo

As nanopartículas lipídicas são desenvolvidas usando uma abordagem de plataforma de mistura microfluida para encapsulamento de mRNA e DNA.

Resumo

Os portadores de medicamentos à base de lipídio têm sido usados para sistemas de entrega clinicamente e comercialmente disponíveis devido ao seu pequeno tamanho, biocompatibilidade e alta eficiência de encapsulamento. O uso de nanopartículas lipídicas (LNPs) para encapsular ácidos nucleicos é vantajoso para proteger o RNA ou DNA da degradação, ao mesmo tempo em que promove a absorção celular. Os LNPs geralmente contêm múltiplos componentes lipídesis, incluindo um lipídio ionizável, lipídio auxiliar, colesterol e lipídio conjugado de polietileno glicol (PEG). Os LNPs podem facilmente encapsular ácidos nucleicos devido à presença lipídica ionizável, que em pH baixo é cationic e permite a complexação com RNA ou DNA carregados negativamente. Aqui os LNPs são formados por encapsular o RNA mensageiro (mRNA) ou DNA plasmídeo (pDNA) usando a mistura rápida dos componentes lipídicos em uma fase orgânica e o componente ácido nucleico em uma fase aquosa. Esta mistura é realizada usando uma plataforma de mistura microfluida precisa, permitindo a automontagem de nanopartículas enquanto mantém o fluxo laminar. O tamanho hidrodinâmico e a polidispersidade são medidos usando dispersão dinâmica de luz (DLS). A carga de superfície eficaz no LNP é determinada medindo o potencial zeta. A eficiência de encapsulamento é caracterizada usando um corante fluorescente para quantificar o ácido nucleico preso. Os resultados representativos demonstram a reprodutibilidade deste método e a influência que diferentes formulações e parâmetros de processo têm sobre as LNPs desenvolvidas.

Introdução

Os portadores de drogas são usados para proteger e fornecer um terapêutico com propriedades favoráveis típicas, incluindo baixa citotoxicidade, aumento da biodisponibilidade e melhor estabilidade^1,2,3. Nanopartículas poliméricas, micelas e partículas à base de lipídios foram previamente exploradas para encapsulamento e entrega de ácido nucleico^4,5,6,7. Lipídios têm sido usados em diferentes tipos de sistemas de nanocarrier, incluindo lipossomos e na

Protocolo

Um esquema do processo global é fornecido na Figura 1.

1. Preparação de tampões

NOTA: A filtragem estéril dos buffers é altamente sugerida aqui para remover quaisquer partículas que possam impactar o ácido nucleico e a qualidade do LNP.

1. Salina Tamponada fosfato (PBS)
   1. Prepare 1x PBS usando 8 mM Na₂HPO₄, 2 mM KH₂PO_4, 137 mM NaCl e 2,7 mM KCl em água livre de nuclease e ajuste o pH para 7,4.
   2. Esterilize por filtragem a vácuo usando um filtro de tamanho de poro de 0,22 μm.
2. Tampão de citrato

Resultados

Vários lotes de LNPs com a mesma formulação lipídica e razão N/P de 6 foram desenvolvidos em dias separados para demonstrar a reprodutibilidade da técnica. Lote 1 e 2 resultaram em distribuições de tamanho sobrepostas com polidispersidade semelhante(Figura 2A) Nenhuma diferença significativa foi observada no tamanho ou eficiência de encapsulamento entre os dois lotes diferentes(Figura 2B). A eficiência de encapsulament...

Discussão

A reprodutibilidade, a velocidade e a triagem de baixo volume são vantagens significativas do uso da mistura microfluida para formar LNPs em comparação com outros métodos existentes (por exemplo, hidratação de filme lipídico e injeção de etanol). Demonstramos a reprodutibilidade deste método sem impacto na eficiência de encapsulamento ou tamanho de partículas observada com diferentes lotes de LNP. Este é um critério essencial para que qualquer terapêutico, incluindo os LNPs, se torne clinicamente disponív...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,2-dimyristoyl-rac-glycero-3-methoxypolyethylene glycol-2000 (C-14 PEG)	Avanti Polar Lipids	880151P
10 µl Graduated Filter Tips  (RNase-,DNase-, DNA-free)	USA Scientific	1121-3810
1000 µl Graduated Filter Tips (RNase-,DNase-, DNA-free)	USA Scientific	1111-2831
20 µl Beveled Filter Tips (RNase-,DNase-, DNA-free)	USA Scientific	1120-1810
200 µl Graudated Filter Tips (RNase-,DNase-, DNA-free)	USA Scientific	1120-8810
3β-Hydroxy-5-cholestene, 5-Cholesten-3β-ol (Cholesterol)	Sigma-Aldrich	C8667
BD Slip Tip Sterile Syringes (1 ml syringe)	Thermo Fisher Scientific	14-823-434
BD Slip Tip Sterile Syringes (3 ml syringe)	Thermo Fisher Scientific	14-823-436
BD Vacutainer General Use Syringe Needles (BD Blunt Fill Needle 18G)	Thermo Fisher Scientific	23-021-020
Benchtop Centrifuge	Beckman coulter
Black 96 well plates	Thermo Fisher Scientific	14-245-177
BrandTech BRAND BIO-CERT RNase-, DNase-, DNA-free microcentrifuge tubes (1.5mL)	Thermo Fisher Scientific	14-380-813
Citric Acid	Fisher Scientific	02-002-611
Corning 500ml Vacuum Filter/Storage Bottle System, 0.22 um pore	Corning	430769
Disposable folded capillary cells	Malvern	DTS1070
Ethyl Alcohol, Pure 200 proof	Sigma-Aldrich	459844
Fisher Brand Semi-Micro Cuvette	Thermo Fisher Scientific	14955127
Invitrogen Conical Tubes (15 mL) (DNase-RNase-free)	Thermo Fisher Scientific	AM12500
MilliporeSigma Amicon Ultra Centrifugal Filter Units	Thermo Fisher Scientific	UFC901024
NanoAssemblr Benchtop	Precision Nanyosystems
Nuclease-free water	Thermo Fisher Scientific	AM9930
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Thermo Fisher Scientific	AM9624
Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit	Thermo Fisher Scientific	P7589
Quant-iT RiboGreen RNA Assay Kit	Thermo Fisher Scientific	R11490
Sodium Chloride	Fisher Scientific	02-004-036
Sodium Citrate, Dihydrate, granular	Fisher Scientific	02-004-056
SpectraMax i3x	Molecular Devices
Zetasizer Nano	Malvern