Des cellules à la synthèse de protéines sans cellules en 24 heures à l’aide d’un flux de travail d’auto-induction sans cellules

Résumé

Ce travail décrit la préparation de l’extrait cellulaire d’Escherichia coli (E. coli) suivie de réactions de synthèse de protéines sans cellules (CFPS) en moins de 24 heures. L’explication du protocole d’auto-induction sans cellule (CFAI) détaille les améliorations apportées pour réduire la surveillance des chercheurs et augmenter les quantités d’extrait cellulaire obtenues.

Résumé

La synthèse de protéines sans cellules (CFPS) s’est développée en tant que plate-forme biotechnologique qui capture les mécanismes de transcription et de traduction in vitro. De nombreux développements ont rendu la plate-forme CFPS plus accessible aux nouveaux utilisateurs et ont élargi la gamme d’applications. Pour les systèmes CFPS à base de lysat, des extraits cellulaires peuvent être générés à partir d’une variété d’organismes, exploitant la biochimie unique de cet hôte pour augmenter la synthèse des protéines. Au cours des 20 dernières années, Escherichia coli (E. coli) est devenu l’un des organismes les plus largement utilisés pour soutenir le SFC en raison de son prix abordable et de sa polyvalence. Malgré de nombreuses avancées clés, le flux de travail pour la préparation de l’extrait de cellules d’E. coli est resté un goulot d’étranglement clé pour les nouveaux utilisateurs qui souhaitent mettre en œuvre CFPS pour leurs applications. Le flux de travail de préparation des extraits prend beaucoup de temps et nécessite une expertise technique pour obtenir des résultats reproductibles. Pour surmonter ces obstacles, nous avons déjà signalé le développement d’un flux de travail d’auto-induction sans cellule (CFAI) 24 heures sur 24 qui réduit les entrées des utilisateurs et l’expertise technique requise. Le flux de travail CFAI minimise le travail et les compétences techniques nécessaires pour générer des extraits de cellules tout en augmentant les quantités totales d’extraits de cellules obtenues. Nous décrivons ici ce flux de travail étape par étape afin d’améliorer l’accès et de soutenir la mise en œuvre à grande échelle du CFPS basé sur E. coli .

Introduction

L’utilisation de la synthèse de protéines sans cellules (CFPS) pour les applications biotechnologiques a considérablement augmenté au cours des dernières années ^1,2,3. Cette évolution peut être attribuée en partie aux efforts accrus déployés pour comprendre les processus qui se produisent dans le SCFFC et le rôle de chaque composante ^4,5. En outre, la réduction des coûts attribuée aux configurations optimisées et aux sources d’énergie alternatives a rendu la technologie sans cellules plus facile à mettre en œuvre pour....

Protocole

1. Croissance des médias

1. Préparer 960 mL de milieu CFAI comme décrit dans le tableau 1 et ajuster le pH à 7,2 à l’aide de KOH.
2. Transférer le milieu de culture dans une fiole et un autoclave déconcertés de 2,5 L pendant 30 min à 121 °C.
3. Préparer une solution de sucre de 40 ml comme décrit dans le tableau 1. Filtrer-stériliser la solution dans un récipient en verre autoclavé séparé.
   REMARQUE: La solution de sucre peut être stockée dans un incubateur à 30 ° C jusqu’à une utilisation ultérieure.
4. Laisser le fluide refroidir complètement à moins de 40 °C après l’autoclavage.
5. Avant l’inocu....

Résultats

Lors de la préparation des milieux CFAI, le glucose a été échangé contre une augmentation du lactose et du glycérol en tant que principal substrat énergétique dans le milieu. De plus, la capacité de mise en mémoire tampon des médias CFAI a également été augmentée. Ces composantes spécifiques sont données dans le tableau 1.

Les cellules ont ensuite été cultivées à la fois à un OD₆₀₀ de 10 et à la norme 2,5 dans les milieux CFAI pour montrer une.......

Discussion

La surveillance des chercheurs est traditionnellement nécessaire pour deux actions clés au cours de la croissance cellulaire : l’induction de l’ARNR T7 et la récolte de cellules à un OD₆₀₀ spécifique. CFAI élimine ces deux exigences pour réduire le temps du chercheur et la formation technique requise pour préparer des extraits cellulaires de haute qualité. L’auto-induction de l’ARNR T7 est obtenue en remplaçant le glucose par du lactose comme sucre primaire dans le milieu, éliminant ainsi le.......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL Microfuge Tubes	Phenix	MPC-425Q
1L Centrifuge Tube	Beckman Coulter	A99028
Avanti J-E Centrifuge	Beckman Coulter	369001
CoA	Sigma-Aldrich	C3144-25MG
Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader	Biotek	BTCYT5F
D-Glucose	Fisher	D16-3
D-Lactose	Alfa Aesar	J66376
DTT	ThermoFisher	15508013
Folinic Acid	Sigma-Aldrich	F7878-100MG
Glycerol	Fisher	BP229-1
Glycine	Sigma-Aldrich	G7126-100G
HEPES	ThermoFisher	11344041
IPTG	Sigma-Aldrich	I6758-1G
JLA-8.1000 Rotor	Beckman Coulter	366754
K(Glu)	Sigma-Aldrich	G1501-500G
K(OAc)	Sigma-Aldrich	P1190-1KG
KOH	Sigma-Aldrich	P5958-500G
L-Alanine	Sigma-Aldrich	A7627-100G
L-Arginine	Sigma-Aldrich	A8094-25G
L-Asparagine	Sigma-Aldrich	A0884-25G
L-Aspartic Acid	Sigma-Aldrich	A7219-100G
L-Cysteine	Sigma-Aldrich	C7352-25G
L-Glutamic Acid	Sigma-Aldrich	G1501-500G
L-Glutamine	Sigma-Aldrich	G3126-250G
L-Histadine	Sigma-Aldrich	H8000-25G
L-Isoleucine	Sigma-Aldrich	I2752-25G
L-Leucine	Sigma-Aldrich	L8000-25G
L-Lysine	Sigma-Aldrich	L5501-25G
L-Methionine	Sigma-Aldrich	M9625-25G
L-Phenylalanine	Sigma-Aldrich	P2126-100G
L-Proline	Sigma-Aldrich	P0380-100G
L-Serine	Sigma-Aldrich	S4500-100G
L-Threonine	Sigma-Aldrich	T8625-25G
L-Tryptophan	Sigma-Aldrich	T0254-25G
L-Tyrosine	Sigma-Aldrich	T3754-100G
Luria Broth	ThermoFisher	12795027
L-Valine	Sigma-Aldrich	V0500-25G
Mg(Glu)2	Sigma-Aldrich	49605-250G
Mg(OAc)2	Sigma-Aldrich	M5661-250G
Microfuge 20	Beckman Coulter	B30134
Molecular Grade Water	Sigma-Aldrich	7732-18-5
NaCl	Alfa Aesar	A12313
NAD	Sigma-Aldrich	N8535-15VL
New Brunswick Innova 42/42R Incubator	Eppendorf	M1335-0000
NH4(Glu)	Sigma-Aldrich	09689-250G
NTPs	ThermoFisher	R0481
Oxalic Acid	Sigma-Aldrich	P0963-100G
PEP	Sigma-Aldrich	860077-250MG
Potassium Phosphate Dibasic	Acros, Organics	A0382124
Potassium Phosphate Monobasic	Acros, Organics	A0379904
PureLink HiPure Plasmid Prep Kit	ThermoFisher	K210007
Putrescine	Sigma-Aldrich	D13208-25G
Spermidine	Sigma-Aldrich	S0266-5G
Tris(OAc)	Sigma-Aldrich	T6066-500G
tRNA	Sigma-Aldrich	10109541001
Tryptone	Fisher Bioreagents	73049-73-7
Tunair 2.5L Baffled Shake Flask	Sigma-Aldrich	Z710822
Ultrasonic Processor	QSonica	Q125-230V/50HZ
Yeast Extract	Fisher Bioreagents	1/2/8013