Des cellules à la synthèse de protéines sans cellules en 24 heures à l’aide d’un flux de travail d’auto-induction sans cellules

Résumé

Ce travail décrit la préparation de l’extrait cellulaire d’Escherichia coli (E. coli) suivie de réactions de synthèse de protéines sans cellules (CFPS) en moins de 24 heures. L’explication du protocole d’auto-induction sans cellule (CFAI) détaille les améliorations apportées pour réduire la surveillance des chercheurs et augmenter les quantités d’extrait cellulaire obtenues.

Résumé

La synthèse de protéines sans cellules (CFPS) s’est développée en tant que plate-forme biotechnologique qui capture les mécanismes de transcription et de traduction in vitro. De nombreux développements ont rendu la plate-forme CFPS plus accessible aux nouveaux utilisateurs et ont élargi la gamme d’applications. Pour les systèmes CFPS à base de lysat, des extraits cellulaires peuvent être générés à partir d’une variété d’organismes, exploitant la biochimie unique de cet hôte pour augmenter la synthèse des protéines. Au cours des 20 dernières années, Escherichia coli (E. coli) est devenu l’un des organismes les plus largement utilisés pour soutenir le SFC en raison de son prix abordable et de sa polyvalence. Malgré de nombreuses avancées clés, le flux de travail pour la préparation de l’extrait de cellules d’E. coli est resté un goulot d’étranglement clé pour les nouveaux utilisateurs qui souhaitent mettre en œuvre CFPS pour leurs applications. Le flux de travail de préparation des extraits prend beaucoup de temps et nécessite une expertise technique pour obtenir des résultats reproductibles. Pour surmonter ces obstacles, nous avons déjà signalé le développement d’un flux de travail d’auto-induction sans cellule (CFAI) 24 heures sur 24 qui réduit les entrées des utilisateurs et l’expertise technique requise. Le flux de travail CFAI minimise le travail et les compétences techniques nécessaires pour générer des extraits de cellules tout en augmentant les quantités totales d’extraits de cellules obtenues. Nous décrivons ici ce flux de travail étape par étape afin d’améliorer l’accès et de soutenir la mise en œuvre à grande échelle du CFPS basé sur E. coli .

Introduction

L’utilisation de la synthèse de protéines sans cellules (CFPS) pour les applications biotechnologiques a considérablement augmenté au cours des dernières années ^1,2,3. Cette évolution peut être attribuée en partie aux efforts accrus déployés pour comprendre les processus qui se produisent dans le SCFFC et le rôle de chaque composante ^4,5. En outre, la réduction des coûts attribuée aux configurations optimisées et aux sources d’énergie alternatives a rendu la technologie sans cellules plus facile à mettre en œuvre pour les nouveaux utilisateurs 6,7,8,9. Afin de mettre en œuvre les facteurs de transcription et de traduction nécessaires à la synthèse des protéines, l’extrait cellulaire est souvent utilisé pour conduire des réactions sans cellules¹⁰. Les guides d’utilisation récemment publiés ont fourni des protocoles simples pour produire un extrait fonctionnel, ce qui le rend plus facile à mettre en œuvre pour les utilisateurs nouveaux et expérimentés ^{1,11,12,13,14}. L’extrait cellulaire est généralement obtenu par la lyse d’une culture cellulaire, qui peut être cultivée en utilisant différents organismes en fonction de l’utilisation spécifique souhaitée ^1,15,16.

Escherichia coli (E. coli) est rapidement devenu l’un des organismes hôtes les plus couramment utilisés pour produire des extraits fonctionnels¹⁷. La souche BL21 Star (DE3) est préférée car elle élimine les protéases de la membrane externe (protéase OmpT) et du cytoplasme (protéase Lon), fournissant un environnement optimal pour l’expression de la protéine recombinante. De plus, le DE3 contient l’λDE3 qui porte le gène de l’ARN polymérase T7 (T7 RNAP) sous le contrôle du promoteur lacUV5; la composante étoile contient un gène RNaseE muté qui empêche le clivage de l’ARNm 4,14,18,19. Sous le promoteur lacUV5, l’induction isopropyl-thiogalactopyranoside (IPTG) permet l’expression de T7 RNAP^20,21. Ces souches sont utilisées pour cultiver et récolter des cellules, qui donnent de la matière première pour la préparation de l’extrait. La lyse cellulaire peut être effectuée à l’aide de diverses méthodes, y compris le battage des billes, la presse à Français, l’homogénéisation, la sonication et la cavitation de l’azote ^1,11,12,22.

Le processus de culture et de récolte bactériennes est cohérent sur la plupart des plates-formes lors de l’utilisation d’E. coli, mais nécessite plusieurs jours et une surveillance intense^{des chercheurs 1,11,13}. Ce processus commence généralement par une culture de graines pendant la nuit dans un bouillon LB, qui, après une croissance nocturne, est ensuite inoculée dans une culture plus grande de 2xYTPG (levure, tryptone, tampon phosphate, glucose) le lendemain. La croissance de cette culture plus grande est surveillée jusqu’à ce qu’elle atteigne la phase logarithmique précoce à moyenne, à une densité optique (OD) de 2,5^14,20. Une mesure constante est nécessaire car il a déjà été démontré que les composants de la transcription et de la traduction sont très actifs dans la phase logarithmique^23,24 du début au milieu de la phase^. Bien que ce processus puisse créer un extrait reproductible, notre laboratoire a récemment mis au point une nouvelle méthode utilisant des milieux d’auto-induction sans cellules (CFAI), qui réduit la surveillance des chercheurs, augmente le rendement global de l’extrait pour un litre donné de culture cellulaire et améliore l’accès à la préparation d’extraits à base d’E. coli pour les utilisateurs expérimentés et nouveaux (Figure 1 ). Nous fournissons ici le guide étape par étape pour la mise en œuvre du flux de travail CFAI, pour passer d’une plaque striée de cellules à une réaction CFPS terminée dans les 24 heures.

Protocole

1. Croissance des médias

1. Préparer 960 mL de milieu CFAI comme décrit dans le tableau 1 et ajuster le pH à 7,2 à l’aide de KOH.
2. Transférer le milieu de culture dans une fiole et un autoclave déconcertés de 2,5 L pendant 30 min à 121 °C.
3. Préparer une solution de sucre de 40 ml comme décrit dans le tableau 1. Filtrer-stériliser la solution dans un récipient en verre autoclavé séparé.
   REMARQUE: La solution de sucre peut être stockée dans un incubateur à 30 ° C jusqu’à une utilisation ultérieure.
4. Laisser le fluide refroidir complètement à moins de 40 °C après l’autoclavage.
5. Avant l’inoculation du milieu CFAI, ajouter la solution de sucre directement au milieu CFAI.
6. Pour inoculer le média, balayez une boucle de colonies à partir d’une plaque E. coli BL21 Star (DE3) précédemment striée et insérez-la directement dans le support. Faites tourbillonner la boucle dans le support, mais évitez de toucher les côtés du récipient. Assurez-vous que la plaque de traînée est fraîche, avec des cellules viables.
7. Placer la fiole avec le milieu inoculé dans un incubateur à 30 °C tout en agitant à 200 tr/min. Permettez à la culture de se développer du jour au lendemain. Si les cellules sont inoculées le soir, la culture atteindra une densité optique approximative, mesurée à 600 nm (OD₆₀₀), de 10 le lendemain matin. Les temps d’inoculation et de récolte peuvent être ajustés au besoin.

2. Récolte cellulaire

1. Préparez le tampon S30 à l’avance et gardez-le au froid. Préparer le tampon S30 conformément au tableau 2, à un pH final de 8,2.
   REMARQUE: Le tampon S30 peut être préparé des jours avant la récolte cellulaire. Si cela est fait, préparer sans dithiothréitol et conserver à 4 °C. Ajouter le dithiothréitol juste avant utilisation.
2. À partir de ce moment, gardez toutes les solutions et tous les matériaux sur la glace. Transférer 1 L de média dans une bouteille de centrifugeuse de 1 L et centrifuger à 5 000 x g entre 4 et 10 °C pendant 10 min. Décantez et éliminez le surnageant. À l’aide d’une spatule stérile, transférer la pastille dans un tube conique de 50 mL pré-refroidi et préalablement pesé.
3. Laver une fois avec 30-40 mL de tampon S30 froid en remettant en suspension la pastille par vortex en rafales de 30 s avec des périodes de repos sur la glace.
   REMARQUE: En raison d’un volume plus élevé de granulés, la division de la pastille de cellule en deux tubes coniques de 50 mL peut être utile pour l’étape de lavage. Le stockage des cellules dans des aliquotes plus petites offre également une flexibilité pour le traitement en aval.
4. Centrifuger la remise en suspension de la cellule à 5000 x g entre 4-10 °C pendant 10 min.
5. Jetez le surnageant et essuyez tout excès des parois intérieures du tube conique de 50 mL à l’aide d’un mouchoir propre, évitez de toucher la pastille elle-même. Peser et congeler la pastille dans de l’azote liquide. Conserver à -80 °C jusqu’à nouvel usage.
   REMARQUE: Les granulés peuvent ne pas nécessiter de congélation éclair si l’utilisateur prévoit de poursuivre le protocole de préparation de l’extrait.

3. Préparation de l’extrait

1. Mélanger la pastille congelée avec 1 mL de tampon S30 pour chaque 1 g de la pastille cellulaire et laisser décongeler sur la glace pendant environ 30 à 60 min. Remettre en suspension les granulés décongelés par vortex en rafales de 30 s avec des périodes de repos sur la glace. Vortex jusqu’à ce qu’il ne reste plus d’amas visibles de cellules.
   REMARQUE: Les touffes plus petites peuvent être remises en suspension en mélangeant à l’aide d’une pipette.
2. Transférer des aliquotes de 1,4 mL de remise en suspension cellulaire dans des tubes de microfuge de 1,5 mL pour la lyse cellulaire. Soniquer chaque tube avec une fréquence de 20 kHz et une amplitude de 50% pendant trois rafales de 45 s avec 59 s de repos par cycle entouré d’un bain de glace. Inverser le tube entre les cycles et ajouter immédiatement 4,5 μL de 1 M de dithiothréitol après le dernier cycle de sonication.
   REMARQUE: En raison de la chaleur libérée par la sonication, il est extrêmement important de s’assurer que toutes les aliquotes sont conservées sur la glace lorsqu’elles ne sont pas soniquées. Le bain de glace doit être constamment réapprovisionné ou suffisamment grand pour rester au frais tout au long du processus de sonication.
3. Centrifuger chaque tube à 18 000 x g et 4 °C pendant 10 min. Récupérer le surnageant et l’aliquote dans des tubes de microfuge de 1,5 mL dans des aliquotes de 600 μL. Congeler les aliquotes et les conserver à -80 °C jusqu’à leur utilisation ultérieure. Il faut veiller à ne pipeter que le surnageant.

4. Synthèse de protéines sans cellules

1. Décongeler une aliquote d’extrait de l’étape précédente pour effectuer 15 μL de réactions de synthèse de protéines sans cellules dans des tubes de microfuge de 1,5 mL dans un quadruplicate.
2. Préparer chaque réaction en combinant 240 ng d’ADN (concentration finale de 16 μg/mL), 2,20 μL de solution A, 2,10 μL de solution B, 5,0 μL d’extrait et un volume variable d’eau de qualité moléculaire pour remplir la réaction à 15 μL. Cette réaction peut être mise à l’échelle à des volumes plus élevés. Voir le tableau 3 pour les ratios.
   1. Préparer les solutions A et B conformément au tableau 4. Chaque solution peut être préparée par lots de 100 μL à 1 mL, aliquoted, et conservée à -80 °C jusqu’à une utilisation ultérieure.
      REMARQUE: La quantité d’ADN peut varier en fonction de la protéine d’intérêt. Dans ce cas, le plasmide utilisé, pJL1-sfGFP, a été optimisé pour fonctionner à 16 μg/mL, soit 597 μM.
3. Laisser les réactions fonctionner pendant au moins 4 h à 37 °C.

5. Quantification de la protéine rapporteure, super dossier protéine fluorescente verte (sfGFP)

1. À l’aide d’une plaque de polystyrène noir à 96 puits d’une demi-surface, combiner 2 μL de chaque produit de réaction de synthèse de protéines sans cellule avec 48 μL de tampon HEPES de 0,05 M à pH 7,2. Trois à quatre répétitions de chaque tube de réaction sont recommandées.
2. Quantifier l’intensité de fluorescence du sfGFP avec une longueur d’onde d’excitation de 485 nm et une longueur d’onde d’émission de 528 nm.
3. Pour la conversion des unités de fluorescence relatives en rendement volumétrique (μg/mL) de sfGFP, établissez une courbe standard en utilisant pJL1-sfGFP purifié.

Résultats

Lors de la préparation des milieux CFAI, le glucose a été échangé contre une augmentation du lactose et du glycérol en tant que principal substrat énergétique dans le milieu. De plus, la capacité de mise en mémoire tampon des médias CFAI a également été augmentée. Ces composantes spécifiques sont données dans le tableau 1.

Les cellules ont ensuite été cultivées à la fois à un OD₆₀₀ de 10 et à la norme 2,5 dans les milieux CFAI pour montrer une...

Discussion

La surveillance des chercheurs est traditionnellement nécessaire pour deux actions clés au cours de la croissance cellulaire : l’induction de l’ARNR T7 et la récolte de cellules à un OD₆₀₀ spécifique. CFAI élimine ces deux exigences pour réduire le temps du chercheur et la formation technique requise pour préparer des extraits cellulaires de haute qualité. L’auto-induction de l’ARNR T7 est obtenue en remplaçant le glucose par du lactose comme sucre primaire dans le milieu, éliminant ainsi le...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL Microfuge Tubes	Phenix	MPC-425Q
1L Centrifuge Tube	Beckman Coulter	A99028
Avanti J-E Centrifuge	Beckman Coulter	369001
CoA	Sigma-Aldrich	C3144-25MG
Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader	Biotek	BTCYT5F
D-Glucose	Fisher	D16-3
D-Lactose	Alfa Aesar	J66376
DTT	ThermoFisher	15508013
Folinic Acid	Sigma-Aldrich	F7878-100MG
Glycerol	Fisher	BP229-1
Glycine	Sigma-Aldrich	G7126-100G
HEPES	ThermoFisher	11344041
IPTG	Sigma-Aldrich	I6758-1G
JLA-8.1000 Rotor	Beckman Coulter	366754
K(Glu)	Sigma-Aldrich	G1501-500G
K(OAc)	Sigma-Aldrich	P1190-1KG
KOH	Sigma-Aldrich	P5958-500G
L-Alanine	Sigma-Aldrich	A7627-100G
L-Arginine	Sigma-Aldrich	A8094-25G
L-Asparagine	Sigma-Aldrich	A0884-25G
L-Aspartic Acid	Sigma-Aldrich	A7219-100G
L-Cysteine	Sigma-Aldrich	C7352-25G
L-Glutamic Acid	Sigma-Aldrich	G1501-500G
L-Glutamine	Sigma-Aldrich	G3126-250G
L-Histadine	Sigma-Aldrich	H8000-25G
L-Isoleucine	Sigma-Aldrich	I2752-25G
L-Leucine	Sigma-Aldrich	L8000-25G
L-Lysine	Sigma-Aldrich	L5501-25G
L-Methionine	Sigma-Aldrich	M9625-25G
L-Phenylalanine	Sigma-Aldrich	P2126-100G
L-Proline	Sigma-Aldrich	P0380-100G
L-Serine	Sigma-Aldrich	S4500-100G
L-Threonine	Sigma-Aldrich	T8625-25G
L-Tryptophan	Sigma-Aldrich	T0254-25G
L-Tyrosine	Sigma-Aldrich	T3754-100G
Luria Broth	ThermoFisher	12795027
L-Valine	Sigma-Aldrich	V0500-25G
Mg(Glu)2	Sigma-Aldrich	49605-250G
Mg(OAc)2	Sigma-Aldrich	M5661-250G
Microfuge 20	Beckman Coulter	B30134
Molecular Grade Water	Sigma-Aldrich	7732-18-5
NaCl	Alfa Aesar	A12313
NAD	Sigma-Aldrich	N8535-15VL
New Brunswick Innova 42/42R Incubator	Eppendorf	M1335-0000
NH4(Glu)	Sigma-Aldrich	09689-250G
NTPs	ThermoFisher	R0481
Oxalic Acid	Sigma-Aldrich	P0963-100G
PEP	Sigma-Aldrich	860077-250MG
Potassium Phosphate Dibasic	Acros, Organics	A0382124
Potassium Phosphate Monobasic	Acros, Organics	A0379904
PureLink HiPure Plasmid Prep Kit	ThermoFisher	K210007
Putrescine	Sigma-Aldrich	D13208-25G
Spermidine	Sigma-Aldrich	S0266-5G
Tris(OAc)	Sigma-Aldrich	T6066-500G
tRNA	Sigma-Aldrich	10109541001
Tryptone	Fisher Bioreagents	73049-73-7
Tunair 2.5L Baffled Shake Flask	Sigma-Aldrich	Z710822
Ultrasonic Processor	QSonica	Q125-230V/50HZ
Yeast Extract	Fisher Bioreagents	1/2/8013