Dalle cellule alla sintesi proteica senza cellule entro 24 ore utilizzando il flusso di lavoro di autoinduzione senza cellule

Riepilogo

Questo lavoro descrive la preparazione dell'estratto cellulare di Escherichia coli (E. coli) seguito da reazioni di sintesi proteica senza cellule (CFPS) in meno di 24 ore. La spiegazione del protocollo CFAI (Cell-Free Autoinduction) descrive i miglioramenti apportati per ridurre la supervisione dei ricercatori e aumentare le quantità di estratto cellulare ottenuto.

Abstract

La sintesi proteica senza cellule (CFPS) è cresciuta come piattaforma biotecnologica che cattura i macchinari di trascrizione e traduzione in vitro. Numerosi sviluppi hanno reso la piattaforma CFPS più accessibile ai nuovi utenti e hanno ampliato la gamma di applicazioni. Per i sistemi CFPS a base di lisato, gli estratti cellulari possono essere generati da una varietà di organismi, sfruttando la biochimica unica di quell'ospite per aumentare la sintesi proteica. Negli ultimi 20 anni, Escherichia coli (E. coli) è diventato uno degli organismi più utilizzati per sostenere la CFPS grazie alla sua convenienza e versatilità. Nonostante i numerosi progressi chiave, il flusso di lavoro per la preparazione dell'estratto di cellule di E. coli è rimasto un collo di bottiglia chiave per i nuovi utenti per implementare CFPS per le loro applicazioni. Il flusso di lavoro di preparazione dell'estratto richiede molto tempo e richiede competenze tecniche per ottenere risultati riproducibili. Per superare queste barriere, abbiamo precedentemente segnalato lo sviluppo di un flusso di lavoro CFAI (Cell-Free Autoinduction) 24 ore su 24 che riduce l'input dell'utente e le competenze tecniche richieste. Il flusso di lavoro CFAI riduce al minimo il lavoro e le competenze tecniche necessarie per generare estratti di cellule, aumentando al contempo le quantità totali di estratti cellulari ottenuti. Qui descriviamo quel flusso di lavoro in modo graduale per migliorare l'accesso e supportare l'ampia implementazione della CFPS basata su E. coli .

Introduzione

L'uso della sintesi proteica senza cellule (CFPS) per applicazioni biotecnologiche è cresciuto notevolmente negli ultimi anni ^1,2,3. Questo sviluppo può essere attribuito in parte a maggiori sforzi nella comprensione dei processi che si verificano nelle CFPS e del ruolo di ciascun componente ^4,5. Inoltre, i costi ridotti attribuiti a configurazioni ottimizzate e fonti di energia alternative hanno reso la tecnologia senza celle più facile da implementare per i nuovi utenti 6,7,8,9. Al fine di implementare i fattori di trascrizione e traduzione necessari per la sintesi proteica, l'estratto cellulare viene spesso utilizzato per guidare le reazioni prive di cellule¹⁰. Le guide per l'utente pubblicate di recente hanno fornito protocolli semplici per la produzione di estratti funzionali, rendendo più facile l'implementazione per gli utenti nuovi ed esperti ^{1,11,12,13,14}. L'estratto cellulare è solitamente ottenuto attraverso la lisi di una coltura cellulare, che può essere coltivata utilizzando diversi organismi a seconda dell'uso specifico desiderato ^1,15,16.

Escherichia coli (E. coli) è diventato rapidamente uno degli organismi ospiti più comunemente utilizzati per la produzione di estratti funzionali¹⁷. Il ceppo BL21 Star (DE3) è preferito perché rimuove le proteasi dalla membrana esterna (proteasi OmpT) e dal citoplasma (proteasi Lon), fornendo un ambiente ottimale per l'espressione proteica ricombinante. Inoltre, il DE3 contiene il λDE3 che trasporta il gene per la T7 RNA polimerasi (T7 RNAP) sotto il controllo del promotore lacUV5; la componente stellare contiene un gene RNaseE mutato che impedisce la scissione dell'mRNA 4,14,18,19. Sotto il promotore lacUV5, l'induzione isopropil-tiogalattopiranoside (IPTG) consente l'espressione di T7 RNAP^20,21. Questi ceppi sono usati per coltivare e raccogliere cellule, che danno materia prima per la preparazione dell'estratto. La lisi cellulare può essere eseguita utilizzando una varietà di metodi, tra cui il battito delle perline, la stampa francese, l'omogeneizzazione, la sonicazione e la cavitazione dell'azoto ^1,11,12,22.

Il processo di coltura e raccolta batterica è coerente nella maggior parte delle piattaforme quando si utilizza E. coli, ma richiede più giorni e un'intensa supervisione del ricercatore ^1,11,13. Questo processo inizia generalmente con una coltura di semi durante la notte in brodo LB, che dopo la crescita durante la notte viene poi inoculata in una coltura più ampia di 2xYTPG (lievito, triptone, tampone fosfato, glucosio) il giorno successivo. La crescita di questa coltura più grande viene monitorata fino a raggiungere la fase logaritmica dall'inizio alla metà, ad una densità ottica (OD) di 2,5^14,20. È necessaria una misurazione costante in quanto i componenti della trascrizione e della traduzione hanno precedentemente dimostrato di essere altamente attivi nella fase di log dall'inizio alla metà^23,24. Mentre questo processo può creare estratto riproducibile, il nostro laboratorio ha recentemente sviluppato un nuovo metodo che utilizza Cell-Free Autoinduction (CFAI) Media, che riduce la supervisione dei ricercatori, aumenta la resa complessiva di estratto per un dato litro di coltura cellulare e migliora l'accesso alla preparazione dell'estratto a base di E. coli sia per gli utenti esperti che per quelli nuovi (Figura 1 ). Qui forniamo la guida passo-passo per l'implementazione del flusso di lavoro CFAI, per passare da una piastra striata di cellule a una reazione CFPS completata entro 24 ore.

Protocollo

1. Crescita dei media

1. Preparare 960 mL di supporti CFAI come descritto nella Tabella 1 e regolare il pH a 7,2 utilizzando KOH.
2. Trasferire i terreni di coltura in un matraccio sconcertato da 2,5 L e in autoclave per 30 minuti a 121 °C.
3. Preparare una soluzione di zucchero da 40 ml come descritto nella Tabella 1. Filtrare la soluzione in un contenitore di vetro autoclavato separato.
   NOTA: La soluzione zuccherina può essere conservata in un incubatore a 30 °C fino a nuovo utilizzo.
4. Lasciare raffreddare completamente il fluido al di sotto dei 40 °C dopo l'autoclave.
5. Prima dell'inoculazione del supporto CFAI, aggiungere la soluzione zuccherina direttamente al supporto CFAI.
6. Per inoculare il supporto, scorrere un ciclo di colonie da una piastra E. coli BL21 Star (DE3) precedentemente striata e inserirla direttamente nel supporto. Ruotare il loop nel supporto ma evitare di toccare i lati del contenitore. Assicurarsi che la piastra striata sia fresca, con cellule vitali.
7. Posizionare il matraccio con il mezzo inoculato in un incubatore a 30 °C agitando a 200 giri/min. Lascia che la cultura cresca durante la notte. Se le cellule vengono inoculate la sera, la coltura raggiungerà una densità ottica approssimativa, misurata a 600 nm (OD₆₀₀), di 10 la mattina successiva. I tempi di inoculazione e raccolta possono essere regolati secondo necessità.

2. Raccolta delle cellule

1. Preparare il buffer S30 in anticipo e tenerlo freddo. Preparare il tampone S30 secondo la Tabella 2, ad un pH finale di 8,2.
   NOTA: il buffer S30 può essere preparato giorni prima della raccolta delle cellule. Se ciò avviene, preparare senza ditiotreitolo e conservare a 4 °C. Aggiungere ditiotreitolo appena prima dell'uso.
2. Da questo punto in poi, mantieni tutte le soluzioni e i materiali sul ghiaccio. Trasferire 1 L di fluido in un flacone di centrifuga da 1 L e centrifugare a 5.000 x g tra 4-10 °C per 10 min. Decantare e smaltire il surnatante. Utilizzando una spatola sterile, trasferire il pellet in un tubo conico pre-refrigerato e precedentemente pesato 50 ml.
3. Lavare una volta con 30-40 mL di tampone S30 freddo risospendendo il pellet tramite vortice in raffiche di 30 s con periodi di riposo sul ghiaccio.
   NOTA: A causa di un volume maggiore di pellet, la divisione del pellet di cella in due tubi conici da 50 ml può essere utile per la fase di lavaggio. La conservazione delle celle in aliquote più piccole offre anche flessibilità per la lavorazione a valle.
4. Centrifugare la risospensione cellulare a 5000 x g tra 4-10 °C per 10 min.
5. Smaltire il surnatante e pulire eventuali eccessi dalle pareti interne del tubo conico da 50 ml utilizzando un fazzoletto pulito, evitare di toccare il pellet stesso. Pesare e congelare il pellet in azoto liquido. Conservare a -80 °C fino a nuovo utilizzo.
   NOTA: i pellet potrebbero non richiedere il congelamento flash se l'utente prevede di continuare con il protocollo di preparazione dell'estratto.

3. Preparazione dell'estratto

1. Unire il pellet congelato con 1 mL di tampone S30 per ogni 1 g di pellet cellulare e lasciare scongelare sul ghiaccio per circa 30-60 min. Resuspend pellet scongelato tramite vortice in raffiche di 30 s con periodi di riposo su ghiaccio. Vortice fino a quando non rimangono ciuffi visibili di cellule.
   NOTA: i grumi più piccoli possono essere risospesi mescolando usando una pipetta.
2. Trasferire aliquote di 1,4 mL di risospensione cellulare in tubi da microfuga da 1,5 mL per la lisi cellulare. Sonicare ogni tubo con una frequenza di 20 kHz e un'ampiezza del 50% per tre raffiche di 45 s con 59 s di riposo per ciclo circondato da un bagno di ghiaccio. Invertire il tubo tra i cicli e aggiungere immediatamente 4,5 μL di 1 M di ditiotreitolo dopo l'ultimo ciclo di sonicazione.
   NOTA: A causa del calore rilasciato dalla sonicazione, è estremamente importante assicurarsi che tutte le aliquote siano mantenute sul ghiaccio quando non vengono sonicate. Il bagno di ghiaccio deve essere costantemente reintegrato o abbastanza grande da rimanere fresco durante l'intero processo di sonicazione.
3. Centrifugare ogni tubo a 18.000 x g e 4 °C per 10 min. Recuperare il surnatante e l'aliquota in tubi di microfuga da 1,5 mL in aliquote da 600 μL. Aliquote di congelamento lampo e conservazione a -80 °C fino a nuovo utilizzo. Bisogna fare attenzione a pipettare solo il surnatante.

4. Sintesi proteica senza cellule

1. Scongelare un'aliquota di estratto dalla fase precedente per eseguire 15 μL di reazioni di sintesi proteica prive di cellule in tubi di microfuga da 1,5 mL in quadruplicato.
2. Preparare ogni reazione combinando 240 ng di DNA (16 μg/mL di concentrazione finale), 2,20 μL di Soluzione A, 2,10 μL di Soluzione B, 5,0 μL di estratto e un volume variabile di acqua di grado molecolare per riempire la reazione a 15 μL. Questa reazione può essere scalata a volumi più elevati. Vedere la Tabella 3 per i rapporti.
   1. Preparare le soluzioni A e B secondo la Tabella 4. Ogni soluzione può essere preparata in lotti da 100 μL a 1 mL, aliquotata e conservata a -80 °C fino a nuovo utilizzo.
      NOTA: La quantità di DNA può variare a seconda della proteina di interesse. In questo caso, il plasmide utilizzato, pJL1-sfGFP, è stato ottimizzato per funzionare a 16 μg/mL, o 597 μM.
3. Lasciare che le reazioni si svolgano per almeno 4 ore a 37 °C.

5. Quantificazione della proteina reporter, super cartella proteina fluorescente verde (sfGFP)

1. Utilizzando una piastra di polistirene nero a 96 pozzetti a mezza area, combinare 2 μL di ciascun prodotto di reazione di sintesi proteica privo di cellule con 48 μL di tampone HEPES da 0,05 M a pH 7,2. Si raccomandano da tre a quattro repliche di ciascun tubo di reazione.
2. Quantificare l'intensità di fluorescenza della sfGFP con una lunghezza d'onda di eccitazione di 485 nm e una lunghezza d'onda di emissione di 528 nm.
3. Per la conversione delle unità di fluorescenza relative alla resa volumetrica (μg/mL) di sfGFP, stabilire una curva standard utilizzando pJL1-sfGFP purificato.

Risultati

Durante la preparazione dei mezzi CFAI, il glucosio è stato scambiato per un aumento del lattosio e del glicerolo come principale substrato energetico nel mezzo. Inoltre, è stata aumentata anche la capacità di buffering dei media CFAI. Questi componenti specifici sono riportati nella Tabella 1.

Le cellule sono state quindi coltivate sia a un OD₆₀₀ di 10 che allo standard 2,5 nei mezzi CFAI per mostrare coerenza con la qualità dell'estratto nonostante le diverse ...

Discussione

La supervisione dei ricercatori è tradizionalmente necessaria per due azioni chiave durante la crescita cellulare: l'induzione di T7 RNAP e la raccolta di cellule a uno specifico OD₆₀₀. CFAI ovvia a entrambi questi requisiti per ridurre il tempo del ricercatore e la formazione tecnica necessaria per preparare estratti cellulari di alta qualità. L'autoinduzione di T7 RNAP si ottiene sostituendo il glucosio con il lattosio come zucchero primario nel mezzo, ovviando alla precedente necessità di monitorare atti...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL Microfuge Tubes	Phenix	MPC-425Q
1L Centrifuge Tube	Beckman Coulter	A99028
Avanti J-E Centrifuge	Beckman Coulter	369001
CoA	Sigma-Aldrich	C3144-25MG
Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader	Biotek	BTCYT5F
D-Glucose	Fisher	D16-3
D-Lactose	Alfa Aesar	J66376
DTT	ThermoFisher	15508013
Folinic Acid	Sigma-Aldrich	F7878-100MG
Glycerol	Fisher	BP229-1
Glycine	Sigma-Aldrich	G7126-100G
HEPES	ThermoFisher	11344041
IPTG	Sigma-Aldrich	I6758-1G
JLA-8.1000 Rotor	Beckman Coulter	366754
K(Glu)	Sigma-Aldrich	G1501-500G
K(OAc)	Sigma-Aldrich	P1190-1KG
KOH	Sigma-Aldrich	P5958-500G
L-Alanine	Sigma-Aldrich	A7627-100G
L-Arginine	Sigma-Aldrich	A8094-25G
L-Asparagine	Sigma-Aldrich	A0884-25G
L-Aspartic Acid	Sigma-Aldrich	A7219-100G
L-Cysteine	Sigma-Aldrich	C7352-25G
L-Glutamic Acid	Sigma-Aldrich	G1501-500G
L-Glutamine	Sigma-Aldrich	G3126-250G
L-Histadine	Sigma-Aldrich	H8000-25G
L-Isoleucine	Sigma-Aldrich	I2752-25G
L-Leucine	Sigma-Aldrich	L8000-25G
L-Lysine	Sigma-Aldrich	L5501-25G
L-Methionine	Sigma-Aldrich	M9625-25G
L-Phenylalanine	Sigma-Aldrich	P2126-100G
L-Proline	Sigma-Aldrich	P0380-100G
L-Serine	Sigma-Aldrich	S4500-100G
L-Threonine	Sigma-Aldrich	T8625-25G
L-Tryptophan	Sigma-Aldrich	T0254-25G
L-Tyrosine	Sigma-Aldrich	T3754-100G
Luria Broth	ThermoFisher	12795027
L-Valine	Sigma-Aldrich	V0500-25G
Mg(Glu)2	Sigma-Aldrich	49605-250G
Mg(OAc)2	Sigma-Aldrich	M5661-250G
Microfuge 20	Beckman Coulter	B30134
Molecular Grade Water	Sigma-Aldrich	7732-18-5
NaCl	Alfa Aesar	A12313
NAD	Sigma-Aldrich	N8535-15VL
New Brunswick Innova 42/42R Incubator	Eppendorf	M1335-0000
NH4(Glu)	Sigma-Aldrich	09689-250G
NTPs	ThermoFisher	R0481
Oxalic Acid	Sigma-Aldrich	P0963-100G
PEP	Sigma-Aldrich	860077-250MG
Potassium Phosphate Dibasic	Acros, Organics	A0382124
Potassium Phosphate Monobasic	Acros, Organics	A0379904
PureLink HiPure Plasmid Prep Kit	ThermoFisher	K210007
Putrescine	Sigma-Aldrich	D13208-25G
Spermidine	Sigma-Aldrich	S0266-5G
Tris(OAc)	Sigma-Aldrich	T6066-500G
tRNA	Sigma-Aldrich	10109541001
Tryptone	Fisher Bioreagents	73049-73-7
Tunair 2.5L Baffled Shake Flask	Sigma-Aldrich	Z710822
Ultrasonic Processor	QSonica	Q125-230V/50HZ
Yeast Extract	Fisher Bioreagents	1/2/8013