Évaluation de l’ubiquitylation du substrat par l’ubiquitine-ligase E3 dans les lysats de cellules de mammifères

Résumé

Nous fournissons un protocole détaillé pour un test d’ubiquitylation d’un substrat spécifique et d’une ubiquitine-ligase E3 dans des cellules de mammifères. Les lignées cellulaires HEK293T ont été utilisées pour la surexpression des protéines, le substrat polyubiquitylé a été purifié des lysats cellulaires par immunoprécipitation et résolu dans SDS-PAGE. L’immunoblotting a été utilisé pour visualiser cette modification post-traductionnelle.

Résumé

L’ubiquitylation est une modification post-traductionnelle qui se produit dans les cellules eucaryotes et qui est essentielle à la régulation de plusieurs voies biologiques, y compris la survie, la prolifération et la différenciation cellulaires. Il s’agit d’un processus réversible qui consiste en une fixation covalente de l’ubiquitine au substrat par une réaction en cascade d’au moins trois enzymes différentes, composées de E1 (enzyme d’activation de l’ubiquitine), E2 (enzyme conjuguant l’ubiquitine) et E3 (enzyme ubiquitine-ligase). Le complexe E3 joue un rôle important dans la reconnaissance et l’ubiquitylation du substrat. Ici, un protocole est décrit pour évaluer l’ubiquitylation du substrat dans les cellules de mammifères en utilisant la co-transfection transitoire d’un plasmide codant pour le substrat sélectionné, une ligase d’ubiquitine E3 et une ubiquitine marquée. Avant la lyse, les cellules transfectées sont traitées avec l’inhibiteur du protéasome MG132 (carbobenzoxy-leu-leu-leucinal) pour éviter la dégradation protéasomique du substrat. En outre, l’extrait cellulaire est soumis à une immunoprécipitation (IP) à petite échelle pour purifier le substrat polyubiquitylé en vue d’une détection ultérieure par transfert western (WB) à l’aide d’anticorps spécifiques pour l’étiquette ubiquitine. Par conséquent, un protocole cohérent et simple pour le dosage de l’ubiquitylation dans les cellules de mammifères est décrit pour aider les scientifiques à traiter l’ubiquitylation de substrats spécifiques et les ligas d’ubiquitine E3.

Introduction

Les modifications post-traductionnelles (PTM) sont un mécanisme important concernant la régulation des protéines, qui est essentielle pour l’homéostasie cellulaire. L’ubiquitylation des protéines est une modification dynamique et complexe qui crée un assortiment de différents signaux entraînant plusieurs résultats cellulaires chez les organismes eucaryotes. L’ubiquitylation est un processus réversible consistant en la fixation d’une protéine d’ubiquitine contenant 76 acides aminés au substrat, se produisant dans une cascade enzymatique composée de trois réactions distinctes¹. La première étape est caractérisée par l’activation de l’ubiquitine, qui dépend d’une hydrolyse de l’ATP pour former une ubiquitine liée au thioester de haute énergie entre l’ubiquitine C-terminus et le résidu de cystéine présent dans le site actif de l’enzyme E1. Par la suite, l’ubiquitine est transférée à l’enzyme E2 formant un complexe semblable à un thioester avec l’ubiquitine. Par la suite, l’ubiquitine est fixée de manière covalente au substrat par l’E2, ou plus souvent, par l’enzyme E3, qui reconnaît et interagit avec le substrat ^2,3. Parfois, des enzymes E4 (facteurs d’allongement de la chaîne ubiquitine) sont nécessaires pour favoriser l’assemblage de la chaîne multiubiquitine³.

L’ubiquitine a sept résidus de lysine (K6, K11, K27, K29, K33, K48 et K63), permettant la formation de chaînes de polyubiquitine qui génèrent des liaisons distinctes pour produire différentes structures tridimensionnelles qui vont être reconnues par plusieurs protéines effectrices ^4,5. Par conséquent, le type de chaîne de polyubiquitine introduit dans le substrat est essentiel pour décider de son devenir cellulaire ^6,7,8. De plus, le substrat pourrait également être ubiquitiné par ses résidus N-terminaux appelés N-dégrons. Les ubiquitine-ligases E3 spécifiques sont responsables de la reconnaissance du N-degron, permettant la polyubiquitylation du résidu de lysine⁹ à proximité.

De nos jours, il existe plus de 40 substrats différents spécifiques au SCF caractérisés. Parmi ceux-ci, les principaux régulateurs de plusieurs voies biologiques, y compris la différenciation et le développement^cellulaires ainsi que la survie et la mort cellulaires, peuvent être ^trouvés 10,11,12,13. Ainsi, l’identification de substrats spécifiques de chaque ubiquitine-ligase E3 est essentielle pour concevoir une carte complète des différents événements biologiques. Même si l’identification de véritables substrats est biochimiquement difficile, l’utilisation de méthodes basées sur la biochimie est très appropriée pour évaluer la spécificité de la chaîne et la distinction entre mono- et polyubiquitylation¹⁴. Cette étude décrit un protocole complet pour le dosage de l’ubiquitylation utilisant la lignée cellulaire de mammifères HEK293T surexprimant le substrat UXT-V2 (Ubiquitously expressed prefoldin-like chaperone isoform 2) avec le complexe E3 ubiquitine-ligase SCF (Fbxo7). L’UXT-V2 est un cofacteur essentiel pour la signalisation NF-κB, et une fois que cette protéine est renversée dans les cellules, elle inhibe l’activation NF-κB induite par le TNF-α¹¹. Ainsi, pour détecter l’UXT-V2 polyubiquitylé, l’inhibiteur du protéasome MG132 est utilisé puisqu’il a la capacité de bloquer l’activité protéolytique de la sous-unité 26S du complexe protéasome¹⁵. En outre, l’extrait cellulaire est soumis à une IP à petite échelle pour purifier le substrat, en utilisant un anticorps spécifique immobilisé en résine d’agarose pour une détection ultérieure par WB à l’aide d’anticorps sélectionnés. Ce protocole est très utile pour valider l’ubiquitylation du substrat dans l’environnement cellulaire, et il peut également être adapté à différents types de cellules de mammifères et à d’autres complexes E3 ubiquitine-ligase. Cependant, il est nécessaire de valider le substrat testé par un test d’ubiquitylation in vitro, car les deux protocoles se complètent en ce qui concerne l’identification de véritables substrats.

Protocole

REMARQUE : La figure 1 présente un aperçu du protocole de dosage de l’ubiquitylation dans les cellules de mammifères.

Graphique 1. Vue d’ensemble de la procédure de dosage de l’ubiquitylation. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

1. Culture cellulaire

1. Cultiver la lignée cellulaire HEK293T dans une boîte de culture traitée par TC de 100 mm jusqu’à une confluence de 80 % à 90 % dans les milieux de croissance (DMEM (Modified Eagle’s Medium) de Dulbecco enrichi en 10 % de sérum fœtal bovin (FBS) et de pénicilline (100 unités), de streptomycine (100 μg) et de L-glutamine (0,292 mg/mL)). Incuber la culture à 37 °C dans un incubateur de culture cellulaire humidifié à 5 % de CO₂.
2. Pour passer les cellules, aspirer le milieu de la boîte de culture à l’aide d’une pipette sérologique. Lavez les cellules une fois avec 1 mL de solution saline stérilisée 1x tamponnée au phosphate (PBS 1x).
3. Détachez les cellules en ajoutant 1 mL de solution de trypsine/EDTA (acide éthylènediaminetétraacétique). Incuber le plat à 37 °C pendant 5 min. Remettre en suspension les cellules à l’aide d’une pipette sérologique dans 2 mL de milieu de croissance.
4. Transférer la suspension cellulaire dans un tube frais et propre de 15 mL et centrifuger à 500 x g pendant 5 min à température ambiante (RT). Retirez le surnageant en le versant soigneusement. Remettez doucement en suspension la pastille cellulaire dans 3 mL de milieu de croissance en pipetant de haut en bas pour obtenir une suspension cellulaire homogène.
5. Transférer 1 mL de la suspension cellulaire dans une boîte de culture traitée par TC de 100 mm contenant 9 mL de milieu de croissance.
   REMARQUE: Si les cellules sont dans de bonnes conditions, chaque plat de culture de HEK293T, dans lequel la confluence est de 80% à 90%, peut générer trois plats de culture avec une confluence de 80% 2 jours après le passage.

2. Transfection cellulaire

REMARQUE: Il n’est pas recommandé de transfecter la culture cellulaire si la confluence atteinte est inférieure à 80%.

1. Avant la transfection, certifier si les cellules sont exemptes de contamination et à une confluence adéquate pour les transfections transitoires.
2. Pour chaque échantillon de transfection, préparer les complexes ADN-polyéthylène (PEI 1 μg/μL à pH 7,2) comme suit :
   1. Diluer 3 μg de chaque plasmide dans 100 μL d’opti-MEM I milieu sérique réduit sans supplémentation et mélanger doucement en pipetant la solution de haut en bas.
      NOTE: Ici, les cellules ont été transfectées avec 4 μg de chaque plasmide: vecteur vide (pcDNA3) ou FLAG-Fbxo7 construits et UXT-V2-HA, avec ou sans 6xHis-myc-ubiquitine. La teneur totale en ADN était de 12 μg.
   2. Décongeler l’Î.-P.-É. à TA et l’ajouter à la solution en suivant une proportion de 3 μL d’Î.-P.-É. par 1 μg d’ADN. Homogénéiser la solution en pipetant de haut en bas. Ensuite, incubez-le pendant 15 min à TA pour permettre la formation de complexes ADN-PEI.
      REMARQUE : La proportion optimale du volume de l’Île-du-Prince-Édouard par quantité d’ADN diffère selon la lignée cellulaire sélectionnée.
3. Ajoutez le volume total de complexes ADN-PEI à chaque plat contenant la culture cellulaire et mélangez-le doucement en berçant la plaque d’avant en arrière. Incuber les cellules à 37 °C dans un incubateur de culture cellulaire humidifié à 5 % de CO₂.
4. Remplacez le milieu de croissance après 5 h, car une exposition prolongée à l’Île-du-Prince-Édouard peut être toxique pour les cellules HEK293T. Incuber les cellules à 37 °C dans un incubateur de culture cellulaire humidifié à 5% de CO₂ pendant 36 h.

3. Lyse cellulaire et immunoprécipitation

1. Après la période d’incubation et 6 h avant la lyse cellulaire, traiter les cellules transfectées avec 10 μM de l’inhibiteur du protéasome MG-132. Encore une fois, incuber les cellules à 37 °C dans un incubateur de culture cellulaire humidifié à 5% de CO₂.
2. Aspirer le milieu de chaque plat de culture à l’aide d’une pipette sérologique et le laver une fois avec 1 mL de 1x PBS. Détachez les cellules en ajoutant 1 mL de trypsine et en incubant le plat à 37 °C pendant 5 min. Remettre en suspension les cellules dans 1 mL de milieu de croissance.
3. Transférer la suspension cellulaire dans un tube frais et propre de 15 mL et centrifuger à 500 x g pendant 5 min à TA.
4. Retirez le surnageant en le versant soigneusement. Remettre doucement la pastille cellulaire dans 200 μL de tampon de lyse NP-40 glacé (50 mM Tris-HCl pH 7,2, 225 mM KCl et 1 % NP-40), complété par le cocktail d’inhibiteurs de protéase et de phosphatase (10 mM NaF et 1 mM Na₃VO₄), et transférer la solution dans un microtube propre de 1,5 mL.
5. Incuber le lysat cellulaire pendant 30 min sur de la glace. Après incubation, centrifuger les lysats cellulaires à 16 900 x g pendant 20 min à 4 °C.
6. Pendant ce temps, équilibrez les perles d’agarose-anti-HA avec un tampon de lyse NP-40 glacé. Utilisez 15 μL de billes d’agarose-anti-HA pour chaque échantillon. Lavez les billes avec 200 μL de tampon de lyse NP-40 en les pulsant dans un tube de microcentrifugation à 3 000 x g pendant 1 min à 4 °C. Avec une pipette, aspirer et jeter le surnageant très soigneusement; répétez ce processus trois fois. Ensuite, gardez les perles équilibrées sur de la glace jusqu’à utilisation.
7. Après avoir centrifugé les lysats cellulaires, récupérez le surnageant. Quantifier la teneur en protéines du lysat total à l’aide de la méthode de Bradford¹⁶.
8. S’assurer que chaque échantillon soumis à l’immunoprécipitation présente une quantité égale de protéines. Incuber le volume nécessaire de lysat cellulaire avec les billes d’agarose-anti-HA équilibrées pendant 4 h, en tournant doucement dans un incubateur rotatif à 4 °C, ce qui permet à l’UXT-V2-HA de se lier aux billes d’agarose-anti-HA.
9. Recueillir les billes d’agarose-anti-HA en les pulsant dans un tube de microcentrifugation à 3 000 x g pendant 1 min à 4 °C. Aspirer soigneusement et jeter le surnageant. Lavez les billes trois fois avec un tampon de lyse cellulaire NP-40 glacé et deux fois avec un tampon FLAG/HA glacé (10 mM Hepes pH 7,9, 15 mM MgCl2, 225 mM KCl et 0,1 % NP-40).
10. Après le lavage final, retirer soigneusement tout le surnageant à l’aide d’une pipette et éluer la protéine polyubiquitylée avec le peptide HA (300 μg/mL) dilué sur un tampon FLAG/HA. Incuber les billes d’agarose-anti-HA avec du peptide HA pendant 1 h à 4 °C dans une plate-forme agitatrice à bascule.
11. Faire tourner les billes à 3 000 x g pendant 2 min à 4 °C et pipeter soigneusement le surnageant contenant les protéines polyubiquitinées. Si nécessaire, conservez l’éluat dans un microtube frais et propre à -20 °C.
12. Résoudre les éluats et les lysats cellulaires dans 10% de SDS-PAGE (électrophorèse sur gel de dodécylsulfate de sodium-polyacrylamide)¹⁷ et immunoblotting.
13. Dans cette étude, un transfert humide WB a été effectué. Pour ce type de transfert, placez le gel dans un sandwich de transfert composé de papier filtre-gel-membrane-papier filtre, amortissez-le avec des tampons et pressez-le ensemble par une grille de support. Placez ce système verticalement dans un réservoir rempli de tampon de transfert et entre des électrodes en acier inoxydable / fil de platine. Le transfert a lieu pendant 90 min à 150 V dans un tampon de transfert humide (glycine 192 mM, tris-base 25 mM, 0,025% SDS, 20% Méthanol).
    REMARQUE: Puisque les extraits cellulaires ont été quantifiés (étape 3.7), exécutez une SDS-PAGE avec une quantité égale de protéines pour chaque échantillon. En outre, pour résoudre l’éluat, exécutez des volumes égaux de chaque échantillon.
14. Sondez la membrane de l’immunoblot à l’aide d’anticorps sélectionnés ¹¹. Assurez-vous qu’un signal de frottis est détecté dans l’éluat du substrat polyubiquitylé tiré dans le processus IP en utilisant un anticorps anti-myc dans les échantillons contenant la ligase E3 de type sauvage, le substrat et le myc-ub. Dans le lysat cellulaire (entrée), assurez-vous que le signal du substrat choisi, de la protéine Fbxo7, des protéines ubiquitylées et d’une protéine d’entretien ménager (par exemple, GAPDH et β-actine) est détecté pour garantir la même quantité de protéines dans chaque voie.
    REMARQUE: La dilution pour chaque anticorps utilisé a été préparée conformément aux instructions du fabricant.

Résultats

L’UXT (transcription exprimée de manière ubiquitaire) est une protéine de type préfoldine qui forme des complexes de repliement des protéines exprimés de manière omniprésente dans les tissus murins et humains tels que le cœur, le cerveau, les muscles squelettiques, le placenta, le pancréas, les reins et le foie¹⁸. Deux isoformes d’épissage d’UXT, nommées UXT-V1 et UXT-V2, ont été décrites comme remplissant des fonctions et des emplacements subcellulaires distincts. L’UXT-V1 ...

Discussion

L’ubiquitylation est une modification post-traductionnelle essentielle qui régule les niveaux de plusieurs protéines et joue un rôle crucial dans de nombreuses voies de signalisation et processus biologiques, assurant un environnement intracellulaire sain. Le système ubiquitine-protéasome (UPS) est l’un des principaux axes de la recherche pharmaceutique récente, offrant la possibilité de stabiliser les suppresseurs de tumeurs ou d’induire la dégradation des produits oncogènes²². Par...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL microtube	Axygen	PMI110-06A
100 mm TC-treated culture dish	Corning	430167
15 mL tube	Corning	430766
96-well plate	Cralplast	655111
Agarose-anti-HA beads	Sigma-Aldrich	E6779
Anti Mouse antibody	Seracare	5220-0341	Goat anti-Mouse IgG
Anti Rabbit antibody	Seracare	5220-0337	Goat anti-Rabbit IgG
Anti-Actin antibody	Sigma-Aldrich	A3853	Dilution used: 1:2000
Anti-Fbxo7 antibody	Sigma-Aldrich	SAB1407251	Dilution used: 1:1000
Anti-HA antibody	Sigma-Aldrich	H3663	Dilution used: 1:1000
Anti-Myc antibody	Cell Signalling	2272	Dilution used: 1:1000
Bradford reagent	Sigma-Aldrich	B6916-500ML
BSA	Sigma-Aldrich	A9647-100G	Bovine Serum Albumin
Cell incubator	Nuaire	NU-4850
Centrifuge	Eppendorf	5804R	500 x g for 5 min
ChemiDoc	BioRad
Digital pH meter	Kasvi	K39-2014B
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium	Corning	10-017-CRV	High glucose
Fetal bovine serum	Gibco	F4135	Filtrate prior use
HA peptide	Sigma-Aldrich	I2149
HEK293T cells	ATCC	CRL-3216
Hepes	Gibco	15630080
KCl	VWR Life Science	0365-500G
Kline rotator	Global Trade Technology	GT-2OIBD
MG-132	Boston Biochem	I-130
Microcentrifuge	Eppendorf	5418R
Na3VO4 (Ortovanadato)
NaF
Nitrocellulose blotting membrane	GE Healthcare	10600016
NP40 (IGEPAL CA-630)	Sigma-Aldrich	I8896-100ML
Optical microscope	OPTIKA microscopes	SN510768
Opti-MEM	Gibco	31985-070
pcDNA3	Invitrogen	V79020	For mammalian expression
pcDNA3-2xFlag-Fbxo7	Kindly donated by Dr. Marcelo Damário		Tag 2xFlag (N-terminal). Restriction enzymes: EcoRI and XhoI
pcDNA3-2xFlag-Fbxo7-ΔF-box	Kindly donated by Dr. Marcelo Damário		Tag 2xFlag (N-terminal). Restriction enzymes: EcoRI and XhoI. Δ335-367
pcDNA3-UXTV2-HA	Kindly donated by Dr. Marcelo Damário		Tag HA (C-terminal). Restriction enzymes: EcoRI and XhoI
pCMV-6xHis-Myc-Ubiquitin	Kindly donated by Dr. Marcelo Damário		Tag 6x-His-Myc (N-terminal). Restriction enzymes: EcoRI and KpnI
Pen Strep Glutamine 100x	Gibco	10378-016
Phosphate buffered saline 10x	AccuGENE	51226	To obtain a 1x PBS, dilute the 10x PBS into ultrapure water
Polyethylenimine (PEI)	Sigma-Aldrich	9002-98-6
Ponceau S	VWR Life Science	0860-50G
Protease inhibitor cocktail SIGMAFAST	Sigma-Aldrich	S8820
Rocking Shaker	Kasvi	19010005
SDS-PAGE system	BioRad	165-8004
Solution Homogenizer	Phoenix Luferco	AP-22
Trizma base	Sigma-Aldrich	T6066-500G
Trypsine (TrypLe Express)	Gibco	12605-028
Western Blotting Luminol Reagent	Santa Cruz Biotechnology	SC-2048