Analyse immunohistochimique multiplex du paysage cellulaire immunitaire spatial du microenvironnement tumoral

Résumé

Ce protocole décrit en détail comment la caractérisation des cellules immunitaires du microenvironnement tumoral à l’aide de l’immunohistochimie multiplex est effectuée.

Résumé

Le paysage cellulaire immunitaire du microenvironnement tumoral contient potentiellement des informations pour la découverte de biomarqueurs pronostiques et prédictifs. L’immunohistochimie multiplex est un outil précieux pour visualiser et identifier différents types de cellules immunitaires dans les tissus tumoraux tout en conservant ses informations spatiales. Nous fournissons ici des protocoles détaillés pour analyser les populations de cellules lymphocytaires, myéloïdes et dendritiques dans des coupes de tissus. De la découpe de sections fixées au formol et noyées en paraffine, des procédures de coloration multiplex automatique sur une plate-forme automatisée, du balayage des lames sur un microscope d’imagerie multispectrale, à l’analyse d’images à l’aide d’un algorithme d’apprentissage automatique développé en interne, ImmuNet. Ces protocoles peuvent être appliqués à une variété d’échantillons tumoraux en changeant simplement de marqueurs tumoraux pour analyser les cellules immunitaires dans différents compartiments de l’échantillon (tumeur ou marge invasive) et appliquer une analyse du voisin le plus proche. Cette analyse ne se limite pas aux échantillons tumoraux mais peut également être appliquée à d’autres tissus (non-)pathogènes. Les améliorations apportées à l’équipement et au flux de travail au cours des dernières années ont considérablement réduit les délais de traitement, ce qui facilite l’application future de cette procédure dans le cadre du diagnostic.

Introduction

Les cellules immunitaires jouent un rôle crucial dans la protection contre les agents pathogènes tels que les virus et les bactéries, mais aussi contre les cellules cancéreuses¹. Par conséquent, le système immunitaire au sein du microenvironnement tumoral (TME) est très prometteur pour la découverte de biomarqueurs pronostiques et prédictifs². Les infiltrats des cellules immunitaires ont été corrélés au pronostic dans divers types de cancer, bien que cela n’ait pas encore été mis en œuvre dans les soins cliniques ^3,4. Dans la plupart des types de tumeurs, un nombre élevé de lymphocytes T cytotoxiques et de lymphocytes T auxiliaires 1 et/ou un faible nombre de lymphocytes T régulateurs sont liés à de bons pronostics. Des efforts sont en cours pour intégrer ce qu’on appelle un « immunoscore » dans la stadification TNM du cancer colorectal, en la transformant en stadification TNM-I ^5,6. L’immunoscore est dérivé du nombre total de lymphocytes T (détectés avec CD3) et de lymphocytes T cytotoxiques (détectés avec CD8) dans deux régions tumorales différentes : le noyau tumoral par rapport à la marge invasive (IM) des tumeurs. Il a également été proposé que l’immunoscore ait une valeur pronostique dans d’autres types de cancer, tels que le mélanome, le cancer du poumon et le cancer du sein 6,7,8,9. De plus, les infiltrats des cellules immunitaires peuvent également être corrélés à la réponse à l’immunothérapie par blocage de point de contrôle¹⁰. Cependant, ces biomarqueurs prédictifs doivent être validés dans des études prospectives avant de pouvoir être systématiquement mis en œuvre dans la pratique clinique. De plus, il a également été proposé qu’un seul biomarqueur soit insuffisant pour une prédiction significative¹¹. Par conséquent, la création d’une carte complète d’un échantillon de patient en combinant différents biomarqueurs a été proposée comme un biomarqueur prédictif plus complet dans ce que l’on appelle « l’immunogramme du cancer »¹².

Parmi les méthodes d’étude des cellules immunitaires au sein de l’EUT, la technique la plus ancienne et la plus connue est l’immunohistochimie (IHC), couramment utilisée pour les tests de diagnostic dans plusieurs maladies, en particulier le cancer¹³. Cette technique a longtemps été limitée à l’utilisation d’un ou de quelques marqueurs¹⁴ et a donc été supplantée dans le cadre de la recherche par d’autres techniques telles que la cytométrie en flux et le profilage d’expression génique (GEP). Cependant, les tissus tumoraux fixés au formol et inclus en paraffine (FFPE) généralement utilisés dans les diagnostics et la recherche de routine ne sont pas (de manière optimale) adaptés à la cytométrie en flux et à la GEP. De plus, bien que la GEP et la cytométrie en flux fournissent beaucoup d’informations sur le phénotype et la fonction cellulaires, le manque d’informations spatiales est un inconvénient majeur. Par conséquent, l’hétérogénéité au sein d’un échantillon, telle que les différences entre les zones infiltrées par les cellules immunitaires et les zones exclues des cellules immunitaires d’une tumeur, pourrait passer inaperçue¹⁵. De nouvelles plateformes ont été développées pour l’analyse multiplex des tissus FFPE, telles que l’IHC multiplex, la cytométrie de masse par imagerie et la détection de CO par indEXing (CODEX) qui peuvent être utilisées pour détecter plusieurs marqueurs simultanément dans une section de tissu¹⁶. Les cellules immunitaires de l’EUT font l’objet d’études approfondies afin de trouver les meilleurs biomarqueurs pour l’immunothérapie. Cependant, les techniques de multiplexage et l’analyse automatisée des images posent leurs propres obstacles.

Notre laboratoire possède une vaste expérience de la coloration IHC multiplex à l’aide de la méthode d’amplification du signal Opal/Tyramide (TSA) et l’a automatisée sur une plate-forme IHC (voir le tableau des matériaux)17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28^, 29,30,31. Nous avons optimisé les panels de cellules immunitaires pour la détection de différents sous-ensembles de lymphocytes, de cellules myéloïdes et de cellules dendritiques (DC). Les tissus qui contiennent des zones de cellules immunitaires denses - pour les lymphocytes ou les morphologies cellulaires complexes (c’est-à-dire les cellules myéloïdes et les DC) - sont particulièrement difficiles à analyser, avec un risque de sur- ou de sous-estimer le nombre de cellules immunitaires présentes. Pour pallier à ce problème, le logiciel d’analyse ImmuNet a été développé par notre groupe³², et ce pipeline d’apprentissage automatique a considérablement amélioré la qualité de la détection de ces différents types de cellules immunitaires. Un protocole détaillé allant de l’obtention du matériel FFPE à l’analyse des densités de cellules immunitaires dans différents compartiments tissulaires et des distances entre les types de cellules immunitaires est décrit ici.

Ce protocole décrit la manière dont les panels IHC multiplexes sont réalisés au Centre médical de l’Université Radboud depuis la mise en œuvre de l’imageur numérique de pathologie en 2022. Les panels IHC multiplexes décrits peuvent être utilisés pour différents carcinomes (par exemple, poumon, prostate, colorectal, vessie, sein) avec l’utilisation d’un anticorps pan-cytokératine comme marqueur tumoral ou pour le mélanome avec l’utilisation d’anticorps associés aux mélanocytes comme marqueurs tumoraux. Ces protocoles IHC multiplex ont été soigneusement optimisés en termes de concentration d’anticorps primaires, de combinaisons de fluorophores et de séquence de la procédure de coloration. Nous et d’autres avons décrit l’optimisation du panel IHC multiplex plus tôt 17,33,34,35. Les panneaux IHC multiplex peuvent être adaptés, mais les pipelines d’analyse décrits doivent être évalués et éventuellement ajustés ou réentraînés en conséquence. Les protocoles IHC multiplexes à sept couleurs décrits utilisent les fluorophores Opal Opal480, Opal520, Opal570, Opal620, Opal690, Opal780 et 4',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI), de sorte qu’un démélange facile et un balayage rapide sur l’imageur sont activés avec l’immunofluorescence multispectrale à une touche (MOTiF). La coloration et le balayage en neuf couleurs ne sont pas décrits dans ce protocole car cela nécessite encore plus de réglage précis de la configuration expérimentale et un autre mode de balayage sur l’imageur qui utilise le filtre accordable à cristaux liquides.

Protocole

Le matériel destiné aux patients qui est présenté pour ce protocole faisait partie d’une étude précédemment menée et a été officiellement considéré comme exempté de l’approbation éthique médicale par le comité local d’éthique médicale Radboudumc conformément à la législation néerlandaise (numéro de dossier 2017-3164)³⁰.

1. Collecte du matériel FFPE, sélection des blocs et préparation des échantillons

1. Récupérez les identifiants de bloc FFPE à partir des dossiers patients auprès des médecins traitants ou des pathologistes. Vérifiez auprès des réglementations locales si une autorisation éthique est requise.
2. Demandez des blocs FFPE auprès des archives de pathologie locales ou d’un ou plusieurs hôpitaux externes.
   REMARQUE : Il est également possible qu’un matériel tumoral ou une biopsie soit acquis pour une étude particulière. Cela peut être le cas pour de petits essais cliniques ou des études sur des animaux. Dans ces cas, le traitement de l’échantillon de tissu peut être la responsabilité du chercheur.
3. Lorsque plusieurs blocs FFPE sont disponibles, sélectionnez le bloc FFPE le plus représentatif contenant du tissu tumoral viable, de préférence avec le tissu stromal environnant présent en évaluant les lames colorées à l’hématoxyline et à l’éosine (HE) (Figure 1).
   REMARQUE : Il est conseillé d’obtenir l’avis d’un expert pour cette sélection (par exemple, un pathologiste). Il est possible que les HE ne soient pas disponibles pour l’évaluation du contenu d’un bloc FFPE et que de nouveaux doivent être créés pour la sélection. Allez à la section 2 pour une description.
4. Découper des rubans FFPE de 4 μm d’épaisseur sur un microtome.
   REMARQUE : L’épaisseur peut être comprise entre 1 μm et 6 μm sans impact notable sur les taches ; Cependant, 4 μm est le plus standard.
5. Montez les échantillons sur des lames de verre à une position favorable à la fluidique de l’autocolorant (Figure 2A-C) en utilisant l’une des méthodes décrites ci-dessous :
   1. Placez les sections à la surface de l’eau distillée à 40 °C dans un bain-marie pour les étirer et ramassez-les avec une lame de verre.
      OU
      Placez les lames de verre sur une plaque chauffante à 40 °C, en veillant à couvrir l’endroit où la section doit être montée sur la lame avec une goutte d’eau distillée. Placez la section au-dessus de cette goutte à l’aide d’une pince et laissez-la s’étirer. Absorbez l’eau distillée à l’aide d’une serviette en papier et retirez l’excès d’eau en tapotant la lame.
      REMARQUE : Placer des sections de tissu trop près de l’étiquette de la lame entraînera une coloration sous-optimale (Figure 2D,E). Nous avons tendance à monter 6 à 10 lames de verre par échantillon pour réaliser les différents panels IHC multiplex et pour avoir une sauvegarde.
6. Laissez sécher les lames de verre montées à 56 °C pendant 1 h ou toute la nuit à 37 °C.
7. Utilisez les lames de verre montées pour l’expérience ou stockez-les dans des boîtes à 4 °C.
   REMARQUE : D’après notre expérience jusqu’à présent, ces lames montées peuvent être stockées pendant des années avant que la coloration IHC multiplex ne soit effectuée.

2. Génération de lames colorées à l’hématoxyline et à l’éosine

REMARQUE : Toutes les étapes suivantes de la section 2 doivent être effectuées dans une hotte.

1. Déparaffiniser les lames dans du xylène (2 x 5 min).
2. Réhydrater dans de l’éthanol (99,6 % 1 x 5 min ; 95 % 1 x 5 min ; 70 % 1 x 2 min). Vous pouvez également tremper les lames 3 fois dans de l’éthanol à 99,6 %.
3. Lavez les lames à l’eau distillée (2 min).
4. Teintez les noyaux avec de l’hématoxyline (10 min).
5. Lavez les lames avec du H₂O distillé (5 min).
6. Colorer les lames avec de l’éosine (5 min).
7. Déshydratez les lames en les trempant 3x dans de l’éthanol à 99,6%.
8. Trempez les lames 2x dans du xylène.
9. Ajoutez quelques gouttes de support de montage et scellez avec une lamelle.
10. Laissez les lames durcir et retirez-les de la hotte lorsque tous les produits chimiques se sont évaporés.

3. Réalisation d’IHC monoplex et multiplex dans l’autocolorateur

1. Calculez la quantité de réactif nécessaire en fonction du nombre d’échantillons à colorer.
   REMARQUE : Par cycle, l’autocolorant a une capacité de 30 lames et prend ~18 h pour compléter le protocole IHC multiplex avec six anticorps. Lorsque plus de lames doivent être colorées, plusieurs lots peuvent être mis en place chaque soir de la semaine (de travail) ; 4 nuits de 30 toboggans = 120 toboggans par semaine.
   1. Préparez tous les réactifs nécessaires au début de la semaine. Le système d’autocoloration distribue 150 μL de réactif par lame. Utilisez les récipients de titrage de 6 mL pour les réactifs d’anticorps et d’opale et les récipients de 30 mL pour le réactif de blocage et l’anticorps secondaire-peroxydase de raifort.
      REMARQUE : Les contenants de 6 ml ont des inserts pratiques qui peuvent facilement être retirés et remplacés si nécessaire. Avec les calculs de réactifs, il faut tenir compte du volume mort de 1,6 mL ou 300 μL pour le récipient de titrage de 30 mL ou 6 mL, respectivement.
   2. Diluer tous les fluorophores d’opale et la digoxigénine (DIG) 1:100 dans le diluant fourni ; diluer Opal780 1:25 dans le diluant de l’anticorps. Diluer tous les anticorps primaires dans le diluant d’anticorps, avec les dilutions spécifiées dans le fichier supplémentaire 1.
2. Pour suivre ce protocole, exécutez l’IHC monoplex (Supplemental File 2) sur des lames contenant à la fois du tissu de contrôle des amygdales et d’autres types de tissus (tumoraux) d’intérêt avant de commencer l’expérience IHC multiplex réelle pour vous assurer que tous les réactifs sont bien préparés.
   REMARQUE : Le monoplex IHC prend ~3,5 h et peut être vérifié avant la fin de cette journée pour les modèles de signal et l’intensité. Si certains signaux sont trop faibles (Figure 3), des ajustements peuvent être apportés aux réactifs.
3. Pour la correction de l’autofluorescence, préparez une lame avec du tissu (tumoral) contenant des structures autofluorescentes, telles que le sang et le collagène. Préparez cette lame en même temps avec des lames IHC monoplexes, mais avec un réactif bloquant remplaçant l’anticorps et les réactifs Opal (Dossier supplémentaire 3).
   REMARQUE : En principe, une telle lame peut être réutilisée pour l’imagerie multispectrale jusqu’à ce que la correction de l’autofluorescence ne soit plus optimale. Cependant, avec des tissus hautement autofluorescents, tels que le cerveau et le foie, il est conseillé d’utiliser ces tissus pour la correction de l’autofluorescence.
4. À chaque cycle IHC multiplex, chargez 29 échantillons dans le système d’autocoloration avec une lame de tissu de contrôle pour vérifier les performances de chaque cycle IHC multiplex.
5. Téléchargez les protocoles IHC multiplex depuis le site Web de l’autostainer sous l’onglet Téléchargements et ajustez-les pour s’adapter à chaque panneau IHC multiplex personnalisé³⁶. Pour l’IHC multiplex, voir le fichier supplémentaire 4 pour le protocole et pour les panneaux IHC multiplex personnalisés, voir le fichier supplémentaire 1.
6. Une fois le protocole de coloration terminé, sortez les lames de l’autocolorateur et mettez-les dans un récipient avec un tampon de lavage.
7. Pour éviter la contamination du système d’autocoloration par le DAPI, car les échantillons sont déjà colorés à de très faibles concentrations, appliquez le DAPI manuellement avant de recouvrir les lames avec des lamelles. Ajouter deux gouttes de DAPI par mL de tampon de lavage et incuber pendant 5 min à température ambiante dans l’obscurité.
   REMARQUE : Pour la construction de bibliothèques spectrales, il est important de ne pas avoir de DAPI coloré dans les échantillons. Une goutte de DAPI par mL de tampon de lavage et 10 min d’incubation à RT sont également possibles.
8. Lavez les lames 3x avec un tampon de lavage.
9. Placez les lames sur du papier absorbant et tapotez l’excédent de tampon de lavage sur les diapositives.
10. Piquez quelques gouttes de milieu de montage sur le tissu.
11. Placez doucement une lamelle en verre sur le support de montage pour couvrir la diapositive à un angle afin d’éviter les bulles d’air.
12. Éliminez l’excès de fluide de montage et les bulles d’air en appuyant doucement sur la lamelle en verre à l’aide d’une pince ou d’une pointe de pipette propre.
13. Laissez les lames intactes pendant ~24 h avant que le support de montage ne se solidifie, soit horizontalement sur une planche à lames de microscopie, soit en les chargeant directement dans le microscope pour l’imagerie.
14. Une fois le support de montage solidifié ou après l’imagerie des lames, stockez les lames dans des boîtes de microscopie à 4 °C.

4. Imagerie à l’aide de l’imageur de pathologie numérique et annotation des fichiers de numérisation

1. Allumez l’imageur en appuyant sur le bouton d’alimentation situé à droite de l’appareil. Après au moins 20 s, démarrez le logiciel.
   REMARQUE : Attendez 20 s pour permettre au matériel de démarrer correctement.
2. Chargez les diapositives dans les cassettes par quatre diapositives.
   1. Facultatif : Entrez les diapositives dans un fichier .csv pour lequel un modèle peut être téléchargé (Fichier supplémentaire 5). Pour charger le fichier .csv dans le programme, enregistrez-le dans C :\Users\Public\Akoya\VectraPolaris\States.
      REMARQUE : Un maximum de 20 cassettes ou 80 diapositives peuvent être chargées simultanément.
3. Paramètres de référence
   1. Ouvrez Check Dashboard dans le menu principal.
      REMARQUE : Une cassette avec des glissières de référence est fournie par le fabricant et peut être maintenue en option en permanence dans l’emplacement 20.
   2. Réglez les références en fond clair sur la diapositive fournie une fois par semaine selon les instructions du fabricant (cela prend quelques minutes).
   3. Réglez les références de fluorescence sur la lame fournie une fois par mois selon les instructions du fabricant (cela prend plus de 1 h).
4. Élaboration ou ajustement du protocole
   1. Revenez au menu principal et cliquez sur Modifier le protocole pour créer un protocole.
   2. Cliquez sur Nouveau... et sélectionnez Fluorescence comme mode d’imagerie, Balayage multispectral de lames et Opal Polaris 5, 6 et 7 couleurs sous l’option Coloration .
   3. Donnez un nom au protocole sous Nom du protocole et enregistrez-le dans une étude en sélectionnant une étude dans Études disponibles ou créez une étude sous Créer une nouvelle étude | Nom de l’étude.
   4. Terminez en sélectionnant Créer un protocole.
   5. Pour ce type de numérisation, utilisez uniquement la fenêtre de gauche Paramètres de numérisation de diapositives multispectrales ; ignorez la fenêtre de droite Paramètres de champ multispectral.
   6. Numérisez les lames à différents grossissements. Pour suivre ce protocole, balayez à un grossissement de 20x en laissant la résolution des pixels à 0,50 μm (20x).
   7. Réglez les temps d’exposition en sélectionnant Expositions de balayage.
   8. Chargez la cassette dans laquelle les glissières sont conservées en sélectionnant la bonne fente sous l’option Porte-charge .
   9. Pour vous aider à naviguer dans les diapositives, sélectionnez Prendre une vue d’ensemble pour acquérir une image d’ensemble du support contenant les diapositives après le chargement du support. Pour l’activer ou la désactiver automatiquement, cliquez sur l’icône d’engrenage en haut à droite, allez dans Préférences..., et cochez l’option activée ou désactivée sous Vue d’ensemble de la navigation Image pour activer le support d’image automatique lors du chargement des tâches interactives.
   10. Réglez les temps d’exposition par filtre sur les lames colorées IHC monoplex correspondantes en sélectionnant Définir les expositions de balayage et en trouvant différents points avec un signal positif. Faites la mise au point manuellement ou utilisez la mise au point automatique et sélectionnez Exposition automatique après avoir basculé vers le filtre compatible pour ce signal. Sélectionnez le temps d’exposition le plus bas pour éviter la surexposition et prenez des instantanés de chaque diapositive à titre de référence une fois que tous les temps d’exposition sont réglés (Figure 3).
       REMARQUE : Ignorez l’option Définir l’exposition des champs pour ce type de numérisation.
   11. Réglez les temps d’exposition sur une lame colorée multiplex en vérifiant tous les filtres à quelques endroits avec un signal positif. Réduisez le temps d’exposition automatique le plus bas de 10 % pour éviter la surexposition et prenez quelques clichés une fois que tous les temps d’exposition sont réglés.
   12. Prenez des instantanés de la lame non colorée pour la compensation de l’autofluorescence à l’aide du filtre AF échantillon pour naviguer (Figure 3H).
       REMARQUE : Les emplacements avec des érythrocytes et des structures de collagène sont intéressants. Il peut être nécessaire de réduire le temps d’exposition du filtre Opal480 pour les régions autofluorescentes fortes. Si le signal Opal480 est suffisamment fort, il doit toujours être bien séparé (voir section 6) des structures autofluorescentes en raison de la mise en œuvre du filtre propriétaire Sample AF.
   13. Évaluer la qualité de la coloration et de l’imagerie à l’aide du logiciel (voir rubriques 5 et 6 ; Figure 4, Fichier supplémentaire 6 : Figure supplémentaire S1 et Figure supplémentaire S2).
   14. Sélectionnez le bouton Enregistrer... pour vous assurer que le protocole et ses temps d’exposition ajustés sont enregistrés dans le protocole.
       REMARQUE : Lorsque le protocole est déjà enregistré, aucune notification supplémentaire des ajustements non enregistrés n’est donnée par le logiciel jusqu’à présent.
5. Numérisation automatique des diapositives
   1. Revenez au menu principal et cliquez sur Numériser les diapositives pour numériser les diapositives.
   2. Entrez manuellement les noms/ID des diapositives ainsi que les tâches et le protocole correspondants sous Configurer les tâches ou automatiquement à partir du fichier .csv précédemment créé avec Charger la configuration.
   3. Cliquez sur Analyser pour lancer l’analyse.
   4. Attendez qu’une fenêtre s’ouvre pour enregistrer la configuration de l’analyse. Cliquez sur Enregistrer pour utiliser les paramètres par défaut et lancer l’analyse.
      REMARQUE : La numérisation à l’aide de cette méthode prend ~10-20 min par lame. Selon le nombre de diapositives, la numérisation peut prendre jusqu’à une journée entière.
   5. Vérifiez si l’analyse des diapositives a réussi pour toutes les diapositives en recherchant des messages d’erreur. Pour savoir si l’analyse a réussi, recherchez un fichier de numérisation de diapositives entières Akoya enregistré (.qptiff) de la numérisation et le tissu complet de la numérisation.

5. Annotation des données à l’aide de la visionneuse de diapositives

1. Revenez au menu principal et cliquez sur Lancer le Phenochart pour ouvrir le visualiseur de diapositives.
2. Si les fichiers numérisés ne sont pas directement visibles, indiquez leur emplacement en cliquant d’abord sur l’icône d’engrenage dans le coin supérieur droit, allez dans Modifier l’emplacement du navigateur... et sélectionnez au hasard l’un des fichiers .qptiff de l’ensemble de données qui vous intéresse.
   REMARQUE : Les données sont stockées par défaut dans D :\Data\VectraPolaris.
3. Chargez une diapositive en la sélectionnant et en cliquant sur Charger dans le coin supérieur droit ou en double-cliquant dessus.
4. Connectez-vous en cliquant sur le bouton Connexion dans le coin supérieur droit.
   REMARQUE : Le nom d’utilisateur peut être simplement les initiales ou le nom et est utilisé pour garder une trace de qui a fait quelles annotations.
5. Pour effectuer le démixage , cliquez sur le bouton Décalage en haut et sélectionnez l’option Opale + AF .
   REMARQUE : Ceci est utile pour se débarrasser d’une partie du signal autofluorescent près du canal Opal 480, mais pas tous.
6. Pour générer un algorithme de traitement par lots des données, sélectionnez des images représentatives à l’aide du tampon à l’aide de l’option pour les images 1 x 1 des projets inForm (taille de l’image : 928 μm x 696 μm).
   REMARQUE : Quelques tampons représentatifs contenant la tumeur, le stroma, l’arrière-plan et différents types de cellules immunitaires sont sélectionnés tout au long de l’ensemble de données pour aboutir à ~20-30 images.
7. En fonction de ce qui doit être analysé dans le tissu, sélectionnez une région d’intérêt à l’aide de l’option ROI et sélectionnez inForm Batch. Supprimez manuellement les images qui n’ont pas besoin d’être analysées, telles que les images qui sont trop éloignées de la tumeur ou en arrière-plan.
   REMARQUE : Nous avons tendance à dessiner un retour d’intérêt autour de l’ensemble de la tumeur et à sélectionner une image supplémentaire loin de la région tumorale pour pouvoir analyser un IM de ~0,5 mm.
   Si le retour sur investissement dessiné est relativement faible, il se composera de 2 à 9 images fusionnées 20x. Comme ce n’est pas notre choix, tamponnez manuellement le tissu d’intérêt (sélectionné pour inForm Batch) pour contourner ce problème.
8. Une fois l’annotation terminée, les annotations sont automatiquement enregistrées et chargent la diapositive suivante.
9. Pendant le processus d’annotation, vérifiez que les diapositives sont correctement numérisées.
   1. S’il manque un fichier .qptiff ou si une lame n’est pas numérisée avec succès, vérifiez s’il y a du tissu sur la lame, nettoyez la lame avec de l’éthanol à 70 % et numérisez à nouveau.
   2. Si le tissu n’est pas entièrement scanné, manquant ainsi une région potentiellement importante (tumeur), ou si le balayage de la région importante était flou, nettoyez la lame avec de l’éthanol à 70% et scannez à nouveau.
      REMARQUE : Dans les deux cas, il peut également être utile d’encercler le tissu avec un marqueur sur le dessus de la lamelle pour aider le système à localiser le tissu et à essayer de le scanner à nouveau (Fichier supplémentaire 6 : Figure supplémentaire S3). Dans nos mains, un marqueur rouge fin fonctionnait mieux qu’un marqueur noir épais.
10. Une fois la numérisation et l’annotation de tous les échantillons terminées, sauvegardez les données en les stockant sur un autre ordinateur ou un disque externe.

6. Démixage spectral

1. Ouvrez le logiciel d’analyse automatisée d’images inForm.
2. Chargez les images dans le logiciel à l’aide de Fichier | Ouvrir l’image ; Sélectionnez les fichiers .qptiff. Laissez les tampons, marqués comme projets inForm à l’étape 5.6, être chargés dans le projet.
3. Chargez les fichiers .qptiff qui sont imagés pour la compensation d’autofluorescence.
4. Pour compenser l’autofluorescence, utilisez l’outil Sélectionner l’autofluorescence sur l’image pour tracer une ligne sur l’image à partir de la lame non colorée à travers différents types de structures autofluorescentes, telles que les érythrocytes et le collagène.
5. Dans la section Modifier les marqueurs et les couleurs... , attribuez des noms de marqueurs qui correspondent au fluorophore Opale et ajustez la couleur à celle que vous préférez.
6. Pour démélanger les fluorophores, sélectionnez Tout préparer dans le coin inférieur gauche.
7. Parcourez les images et vérifiez si tous les signaux sont visibles dans les images et si le démixage s’est bien passé. Sélectionnez l’icône du globe oculaire pour éteindre et rallumez tous les marqueurs un par un pour vérifier la qualité.
8. Si vous le souhaitez, entraînez les algorithmes pour la segmentation des tissus, la segmentation cellulaire et le phénotypage.
9. Allez dans l’onglet Exporter et créez un nouveau répertoire d’exportation vide en cliquant sur le bouton Parcourir... sous le répertoire d’exportation.
10. Sous Images à exporter :, sélectionnez Image composite et Images de composant (TIFF multi-images).
11. Sélectionnez Fichier | Enregistrer | Projet d’enregistrement de l’algorithme à un certain emplacement.
12. Allez dans l’onglet Analyse par lots verticalement à gauche pour le traitement par lots des diapositives.
13. Sélectionnez Créer des répertoires distincts pour chaque élément sous les options d’exportation.
14. Pour ajouter des diapositives à analyser, sélectionnez des fichiers .qptiff sous le bouton Ajouter des diapositives... et chargez-les dans l’analyse par lots.
15. Sélectionnez Exécuter pour démarrer le traitement par lots des diapositives.

7. Dessin du retour sur investissement

1. Créez un dossier avec uniquement les fichiers de composant de la section 6, mais conservez la structure hiérarchique des dossiers intacte (les fichiers de composant se trouvent dans des dossiers nommés par sample/slide).
2. Ouvrez le logiciel de visualisation de diapositives QuPath entier.
3. Cliquez sur Créer un projet sur la gauche et sélectionnez/créez un nouveau dossier vide avec un nom approprié.
4. Cliquez sur Automatiser et sélectionnez Afficher l’éditeur de script.
5. Copiez-collez le script disponible dans le fichier supplémentaire 7. À la ligne 34, modifiez l’emplacement des dossiers de diapositives contenant tous les fichiers de composant (le dossier créé à l’étape 7.1.
6. Sélectionnez Exécuter et revenir lorsque l’assemblage par lots des diapositives est terminé (le lendemain ou plus tard) pour continuer.
7. Faites glisser les fichiers .ome.tif générés dans le projet QuPath et enregistrez-les en tant que projet.
8. Lorsqu’une nouvelle fenêtre s’affiche automatiquement, sélectionnez Définir le type d’image | Fluorescence et cliquez sur Importer.
9. Dans le menu de gauche, observez la liste des échantillons ; double-cliquez sur l’un d’entre eux pour ouvrir l’échantillon (Figure 5A).
10. Pour ajuster l’intensité des canaux afin de les rendre plus visibles, cliquez sur l’icône de contraste.
11. Sélectionnez toutes les chaînes et cliquez sur Réinitialiser.
12. Désactivez l’autofluorescence.
13. Pour commencer à dessiner une ROI pour la tumeur, cliquez sur l’icône de contraste et sélectionnez Afficher les niveaux de gris. Sélectionnez le canal marqueur de la tumeur et ajustez l’intensité pour le rendre visible de manière optimale (Figure 5B).
14. Cliquez sur l’outil pinceau pour dessiner approximativement le retour sur investissement d’une tumeur.
15. Tout en sélectionnant l’outil baguette, cliquez à l’extérieur de la zone d’intérêt tout en appuyant sur la touche Alt pour lisser la zone d’intérêt de l’extérieur (Figure 5C).
16. Fusionnez des morceaux de tumeur séparés avec le même retour sur investissement.
17. Donnez au ROI un nom approprié, tel que tumeur, en cliquant avec le bouton droit de la souris sur l’annotation dans la liste de gauche ; sélectionnez Définir les propriétés et entrez le nom.
18. Pour créer un retour sur investissement pour l’IM, développez le retour sur investissement existant à partir de la région tumorale en sélectionnant : Objets | Annotations... | Développez les annotations.
19. Sélectionnez la taille du rayon d’expansion, puis sélectionnez Supprimer l’intérieur et Contraindre au parent (Figure 5D).
20. Cliquez sur l’icône de contraste, sélectionnez le canal d’autofluorescence et ajustez l’intensité pour le rendre visible de manière optimale.
21. Cliquez sur la baguette et ajustez le retour sur investissement tout en appuyant sur la touche alt pour lisser le retour sur investissement de l’extérieur et supprimer tout arrière-plan qui ne devrait pas faire partie de ce retour sur investissement.
22. Donnez au retour d’investissement un nom approprié, tel que marge invasive ou IM , en cliquant avec le bouton droit de la souris sur l’annotation dans la liste de gauche, en sélectionnant Définir les propriétés, en saisissant le nom et en remplaçant sa couleur par du vert.
23. Enregistrez les annotations : Fichier | Exportation d’objets | Exporter tous les objets et cliquez sur OK avec la sélection par défaut dans Exporter en tant que FeatureCollection et enregistrez-le à l’emplacement de votre choix.

8. Détection des cellules immunitaires

1. Comme ImmuNet utilise des données de composant (fichiers TIFF multicanaux) pour l’entraînement et l’inférence, divisez les annotations en ensembles d’entraînement et de validation. Pour entraîner le modèle, suivez les étapes décrites dans le fichier Readme du référentiel, en remplaçant l’exemple de jeu de données et les annotations par les données souhaitées. En dehors des différentes cellules immunitaires, fournissez au modèle des exemples négatifs en faisant des annotations d’arrière-plan sur des sites qui ne doivent pas être reconnus comme une cellule d’intérêt : cellules tumorales, autres cellules ou « aucune cellule » (structures qui pourraient être confondues avec des cellules d’intérêt) ; voir la publication ImmuNet pour plus de détails³².
2. À l’aide des annotations de validation, assurez-vous que les performances sont satisfaisantes. Examinez le taux d’erreur par type d’annotation (une part d’annotations de validation que le modèle n’a pas détectées), la mesure d’évaluation la plus simple. Évaluez les performances par rapport aux faux positifs en faisant quelques retours sur investissement entièrement annotés et en calculant les scores F.
3. En plus de l’évaluation quantitative, inspectez visuellement la prédiction pour avoir une idée qualitative des erreurs que le modèle a tendance à faire (Figure 6, Fichier supplémentaire 6 : Figure supplémentaire S4 et Figure supplémentaire S5). Si les performances du modèle sont jugées insuffisantes, visualisez la prédiction de certaines vignettes comme décrit dans le référentiel et vérifiez quels sites sont les plus sujets aux erreurs. Faites plus d’annotations sur ces sites et réexécutez l’entraînement et l’évaluation du modèle.
4. Lorsque les performances cibles sont atteintes, exécutez l’inférence pour l’ensemble du jeu de données comme décrit dans la section Inférence pour l’ensemble du jeu de données du fichier Readme du référentiel. Utilisez les fichiers .csv obtenus avec la prédiction du modèle comme entrée pour l’analyse des données (écrivez un script Python ou R pour cela).

9. Prédiction, phénotypage et analyse des données

REMARQUE : Dans cette section, nous donnons un exemple d’analyse de données simple pour un seul échantillon de mélanome coloré avec le panel de lymphocytes, qui combine les emplacements des cellules immunitaires identifiées par ImmuNet (section 8) et les zones d’intérêt délimitées avec QuPath (section 7). L’analyse a été effectuée dans R 4.1.1 (un script est fourni en tant que fichier supplémentaire 8). Le script nécessite les paquets : plyr 1.8.8, dplyr 1.0.8, tidyr 1.2.0, sf 1.0-7, ggplot2 3.4.0, RANN 2.6.1 et RColorBrewer 1.1-2, qui peuvent être installés avec la commande install.packages(). En entrée, il prend un fichier .csv avec la prédiction d’un échantillon d’ImmuNet et un fichier avec des ROI exportés depuis QuPath. Les étapes 9.1 à 9.6 décrivent l’analyse d’un seul échantillon effectuée dans le script fourni, et les sections 9.7 à 9.9 décrivent les options d’analyse de plusieurs échantillons.

1. Après avoir chargé la prédiction d’ImmuNet dans R, déterminez les seuils d’expression des marqueurs prédits en traçant les marqueurs qui définissent les phénotypes les uns par rapport aux autres et en sélectionnant les seuils qui séparent le mieux les populations.
   REMARQUE : La stratégie de contrôle utilisée pour l’échantillon donné est illustrée à la figure 7B. Les stratégies de contrôle pour les panels de cellules myéloïdes et dendritiques sont présentées dans le fichier supplémentaire 6 : figure supplémentaire S6 et figure supplémentaire S7.
2. Après avoir déterminé les seuils, utilisez-les pour attribuer à chaque prédiction ImmuNet un phénotype défini dans un panneau. Dans certaines prédictions, observez qu’aucun des marqueurs prédits n’est au-dessus du seuil ou que la combinaison de marqueurs considérés comme exprimés après le seuillage peut être incohérente (par exemple, les prédictions CD3⁺ CD20⁺ dans les panels de lymphocytes). Si le rendement du modèle est bon à l’étape 8.3, la fraction de ces prédictions sera faible ; Filtrez-les avant l’analyse.
3. Pour analyser séparément les retours sur investissement de la tumeur et sa marge invasive jusqu’à 100 μm dessinée dans QuPath, chargez les fichiers GeoJSON correspondants dans R et, pour chaque prédiction, déterminez le retour sur investissement dans lequel la prédiction se situe.
4. Pour une vérification de l’intégrité et dans le cadre de l’analyse exploratoire des données, visualisez les cellules immunitaires trouvées dans un échantillon séparément dans les zones d’intérêt correspondantes ainsi que les limites des zones d’intérêt (figure 7A).
5. Maintenant, calculez les densités des différentes cellules immunitaires séparément pour chaque retour sur investissement. Les densités trouvées dans l’échantillon donné sont indiquées dans le tableau 1.
6. Si plusieurs échantillons sont disponibles, visualisez la distribution des densités cellulaires. Transformez log-transformer les valeurs de densité pour obtenir des valeurs normalement distribuées.
   REMARQUE : Lorsque le nombre de certains phénotypes est égal à 0, ceux-ci ne peuvent pas être transformés en log, ce qui entraîne des valeurs manquantes. Pour surmonter ce problème, le lissage LaPlacian peut être appliqué en ajoutant 0,5 à tous les comptages cellulaires avant de diviser par la surface.
7. Analysez les valeurs de densité et tracez-les à l’aide du logiciel de votre choix (Figure 8).
8. Les emplacements préservés des cellules permettent l’analyse spatiale. Par exemple, pour chaque cellule immunitaire détectée, trouvez un voisin le plus proche, puis pour chaque phénotype, calculez le pourcentage de cas où les différents phénotypes se produisent comme le voisin le plus proche.
   REMARQUE : Étant donné que le nombre de cellules tueuses naturelles (NK) trouvées dans cet échantillon était très faible, nous les avons exclues de cette analyse. Les résultats obtenus pour les ROI de la tumeur et de l’IM sont donnés à la figure 9.

Discussion

L’analyse spatiale de l’EUT est une technique recherchée pour en savoir plus sur le compartiment cellulaire immunitaire et découvrir de nouveaux biomarqueurs pronostiques et prédictifs, notamment dans le domaine de l’immuno-oncologie¹⁶. De nombreuses techniques différentes sont en cours de développement à cet effet, impliquant la détection de protéines, de transcrits d’ARNm ou d’une combinaison des deux, avec des estimations allant jusqu’à 100 à 1 000 cibles. Cependant, un multiplexage plus élevé se fait au prix d’une réduction du nombre d’expériences à haut débit, de coûts expérimentaux plus élevés et de défis techniques, et souvent, seule une petite partie du TME peut être analysée. L’IHC multiplexe utilisant la méthode basée sur la TSA que nous décrivons ici, détecte simultanément six marqueurs différents + DAPI, est relativement moins coûteux à réaliser et des coupes de tissus entiers sont imagées en moins de 20 minutes, prêtes à être entièrement analysées. Cette technique est devenue moins complexe avec l’automatisation de la procédure de coloration. Les améliorations apportées au microscope multispectral, qui comprennent l’ajout de deux filtres supplémentaires, ont considérablement amélioré les temps de démélange et de balayage spectrals. Il est possible de détecter jusqu’à huit marqueurs différents + DAPI simultanément. Cependant, en étendant le multiplexage avec plus de marqueurs, les avantages susmentionnés disparaissent à mesure que le démixage spectral devient plus difficile et que les temps de balayage de lames entières augmentent considérablement. Des efforts sont entrepris pour normaliser les CSI multiplexes entre les différents établissements afin de faciliter la mise en œuvre dans le cadre du diagnostic. Pour cette standardisation de l’IHC multiplex, nous conseillons aux utilisateurs d’adhérer au protocole plus accessible avec six marqueurs différents + DAPI. Néanmoins, un certain savoir-faire technique est encore nécessaire et l’analyse en aval peut être difficile, pour laquelle nous avons développé des méthodologies qui sont décrites dans ce protocole.

La normalisation commence par le développement de panels IHC multiplex. L’importance du choix des anticorps primaires détectant des cibles protéiques particulières a été soulignée avant¹⁷. Nos panels IHC multiplex sont principalement développés avec des clones d’anticorps primaires qui sont également utilisés et validés pour l’IHC dans notre service de diagnostic. Cependant, dans le cas du panel IHC multiplexe de cellules dendritiques, la plupart des anticorps n’ont pas été utilisés dans le cadre du diagnostic (van der Hoorn et al., manuscrit en cours de soumission). Pour garantir la spécificité et minimiser les différences de lot, nous avons choisi d’utiliser des anticorps monoclonaux plutôt que des anticorps polyclonaux et avons également validé la plupart des anticorps en utilisant des lignées cellulaires transfectées et des cellules primaires. Au fil des ans, différentes versions de panels IHC multiplexes ont été utilisées dans de nombreuses études utilisant le système Vectra 3 18,21,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32. Pour mettre en œuvre ces panels IHC multiplex de manière optimale sur le système PhenoImager HT, certains ajustements ont dû être effectués dans les combinaisons d’anticorps primaires et de fluorophores. Pour bénéficier d’un meilleur démélange spectral et de temps de balayage plus rapides de coupes de tissus entiers, il est nécessaire de mettre en œuvre les derniers fluorophores Opal480 et Opal780 et d’éviter l’utilisation de fluorophores Opal540 et Opal650 dans des panels IHC multiplexes à sept couleurs. Les temps de balayage sont ~3 à 10 fois plus rapides selon la taille de la section de tissu. Les ajustements de panel IHC multiplex ont été assez faciles à réaliser, mais certaines considérations doivent être gardées à l’esprit. Le spectre fluorescent de l’Opal480 chevauche beaucoup le spectre de l’autofluorescence et, par conséquent, interfère avec le démélange spectral des érythrocytes et d’autres structures autofluorescentes. L’utilisation d’une concentration accrue de l’anticorps primaire associé à Opal480 a résolu ce problème dans la plupart des cas. La mise en œuvre du filtre propriétaire Sample AF sur le PhenoImager HT facilite le démélange de l’Opal480 et de l’autofluorescence. Cependant, il est préférable d’utiliser un anticorps primaire qui donne un signal clair lorsqu’il est utilisé avec Opal480 afin que son signal soit supérieur à l’autofluorescence.

Même si ces panels IHC multiplex sont établis, la variation d’un lot à l’autre est quelque chose qui doit être pris en compte. En effectuant des contrôles IHC monoplexes avant de commencer l’expérience IHC multiplex complète, nous avons parfois observé que les anticorps primaires se comportent plus ou moins bien d’une expérience à l’autre. Les raisons peuvent être des erreurs de pipetage, des conditions de stockage des réactifs non optimales et une durée de conservation. Nous avons résolu ce problème en ajustant la solution d’anticorps primaires sur la base de notre expérience. Même lorsqu’aucun des ajustements susmentionnés n’a dû être effectué, pour chaque expérience de lot multiplex IHC, il est important de définir les temps d’exposition en fonction des lames de contrôle monoplex colorées à l’IHC.

Étant donné que notre recherche s’est initialement concentrée sur différents types de carcinomes et de mélanomes, les panels IHC multiplex devaient être interchangeables entre les types de tumeurs avec un minimum d’ajustements. Par conséquent, nous avons toujours inclus plusieurs types de tissus (tumoraux) dans le processus d’optimisation et observé que les dilutions des anticorps primaires pour les marqueurs de cellules immunitaires peuvent être maintenues similaires entre différents types de tumeurs. Cependant, la détection du tissu tumoral entre les carcinomes et le mélanome nécessite des marqueurs tumoraux différents. En conséquence, le marqueur tumoral a toujours été optimisé pour fonctionner à la fin de chaque panel IHC multiplex et est actuellement toujours utilisé en conjonction avec Opal780, qui, par coïncidence, doit également être au dernier fluorophore dans une procédure de coloration IHC multiplex. En utilisant le marqueur tumoral par conséquent à la fin de l’IHC multiplex, ces panels IHC multiplex peuvent être facilement échangés contre d’autres types de tumeurs, tels que le glioblastome (c’est-à-dire GFAP) et le lymphome hodgkinien (c’est-à-dire CD30). Pour l’angiosarcome, nous avons utilisé ce panel IHC multiplexe de lymphocytes avec le gène lié à la transformation de l’érythroblaste (ERG) comme marqueur tumoral avec seulement deux expériences d’optimisation²⁵. L’optimisation comprenait le titrage de l’anticorps primaire ERG et le test du panel IHC multiplex avec ERG à la fin.

D’autres ajustements à ces panels IHC multiplex peuvent également être effectués en échangeant un certain marqueur de cellules immunitaires contre un autre marqueur immunitaire ou fonctionnel. Chaque changement nécessite une optimisation. Le protocole d’optimisation pourrait être suivi comme décrit précédemment¹⁷. Certaines modifications apportées aux panneaux multiplexes IHC proposés interféreront avec les algorithmes ImmuNet que nous avons créés. Il faut générer suffisamment de données et consacrer du temps à la mise en œuvre de ces modifications dans l’algorithme (au moins 750 annotations pour chaque nouveau marqueur et/ou phénotype cellulaire, et 150 annotations pour la validation des marqueurs précédemment formés). Les panels présentés ici ne contiennent pas de marqueurs fonctionnels, bien que l’implémentation de marqueurs de point de contrôle immunitaire tels que-1 et-L1 dans des panels IHC multiplex soit réalisée dans notre laboratoire. Cependant, l’analyse de marqueurs moins binaires dans les signaux négatifs et positifs s’est avérée plus difficile et constitue un domaine de recherche actif dans notre groupe.

Le nombre de marqueurs pouvant être évalués simultanément avec l’IHC multiplex est limité par rapport à d’autres nouvelles techniques. Bien que cela puisse être contourné en analysant différents panneaux sur des tranches consécutives d’un bloc FFPE, il sera difficile de comparer ces tranches spatialement. L’orientation et les artefacts pliés ne sont probablement pas les mêmes après la préparation des diapositives. Néanmoins, l’IHC multiplex est assez accessible, ce qui en fait un outil attrayant pour davantage d’institutions et de chercheurs et donc, plus adapté à une mise en œuvre future dans un cadre de diagnostic. Avec la normalisation des panels de cellules immunitaires IHC multiplex pour plusieurs types de tumeurs et les pipelines d’analyse en aval, davantage de connaissances pourraient être acquises sur les différences de TME entre les patients et les types de tumeurs. Cela peut, par exemple, conduire à plus de connaissances sur le rôle de l’EUT dans la réponse antitumorale à des traitements spécifiques. Cela pourrait même donner naissance à de nouveaux biomarqueurs pour prédire des facteurs tels que la réponse au traitement et la survie attendue. Dans l’ensemble, cela peut permettre à l’IHC multiplex de devenir un outil clinique d’aide à la prise de décision clinique, dans une approche de médecine personnalisée. Certes, davantage d’étapes de la procédure d’analyse devraient probablement être automatisées et standardisées pour qu’elle puisse être utilisée dans un cadre de diagnostic quotidien, de sorte qu’il s’agit pour l’instant d’une perspective principalement futuriste.

L’analyse de plusieurs marqueurs sur une seule lame d’échantillon peut être un outil très puissant malgré ses défis techniques. Avec des protocoles expérimentaux standardisés et une méthode d’analyse robuste, comme nous l’avons décrit ici à l’aide d’ImmuNet, la quantification de plusieurs marqueurs la rend plus informative que l’IHC classique, tandis que l’IHC multiplex reste relativement à haut débit par rapport aux nouvelles méthodes expérimentales à haut plex.

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
anti-CD14	Cell Marque	114R-16	section 3, clone EPR3653
anti-CD163	Cell Marque	163M-15	section 3, clone MRQ-26
anti-CD19	Abcam	ab134114	section 3, clone EPR5906
anti-CD1c (BDCA1)	Thermo Scientific	TA505411	section 3, clone OTI2F4
anti-CD20	Thermo Scientific	MS-340-S	section 3, clone L26
anti-CD3	Thermo Scientific	RM-9107	section 3, clone sp7
anti-CD303/BDCA2	Dendritics via Enzo Lifesciences/Axxora	DDX0043	section 3, clone 124B3.13
anti-CD56	Cell Marque	156R-94	section 3, clone MRQ-42
anti-CD66b	BD Biosciences	555723	section 3, clone G10F5
anti-CD68	Dako Agilent	M087601	section 3, clone PG-M1
anti-CD8	Dako Agilent	M7103	section 3, clone C8/144B
anti-Foxp3	Thermo Scientific	14-4777	section 3, clone 236A/E7
anti-Gp100	Dako Agilent	M063401	section 3, clone HMB45
anti-HLA-DR, DP, DQ	Santa Cruz	sc-53302	section 3, clone CR3/43
anti-MART-1	Thermo Scientific	MS-799	section 3, clone A103
anti-pan cytokeratin	Abcam	ab86734	section 3, clone AE1/AE3 + 5D3
anti-SOX10	Sigma Aldrich	383R	section 3, clone EP268
anti-Tyrosinase	Sanbio	MONX10591	section 3, clone T311
anti-XCR1	Cell Signaling Technologies via Bioké	44665S	section 3, clone D2F8T
antibody diluent	Akoya BioSciences	SKU ARD1001EA	section 3, from Opal 7-Color Automation IHC Kit 50 slide (can optionally also be replaced by TBST with 10% BSA)
Bond Aspirating Probe	Leica Biosciences	S21.0605	section 3
Bond Aspirating Probe Cleaning	Leica Biosciences	CS9100	section 3
Bond Dewax Solution	Leica Biosciences	AR9222	section 3
Bond Objectglas label + print lint	Leica Biosciences	S21.4564.A	section 3
Bond Research Detection System 2	Leica Biosciences	DS9777	section 3
Bond RX autostainer	Leica Biosciences	-	section 3, automated platform
Bond TM Epitope Retrieval 1 - 1 L	Leica Biosciences	AR9961	section 3
Bond TM Epitope Retrieval 2 - 1 L	Leica Biosciences	AR9640	section 3
Bond TM Wash Solution 10x - 1 L	Leica Biosciences	AR9590	section 3
BOND Universal Covertile	Leica Biosciences	S21.4611	section 3
Bond(TM) Titration Kit	Leica Biosciences	OPT9049	section 3
Coverslip 24 x 32 mm #1 (0.13-0.16 mm)	Fisher Scientific	15717592	section 2
coverslip 24 x 50 mm	VWR	631-0146	section 2
DAPI Fluoromount-G	VWR	0100-20	section 3, whenever monoplex slides need to be quickly checked, not for official analysis, then DAPI is stained seperately for better results
Eosine			section 2, home made
Ethanol 99.5%	VWR	4099.9005	section 2
Fluoromount-G	VWR	0100-01	section 3
haematoxyline		-	section 2, home made
ImmuNet		-	immune cell detection and phenotyping pipeline
inForm software 2.4.10	Akoya BioSciences	-	section 4 & 6
OPAL 480 reagent pack	Akoya BioSciences	FP1500001KT	section 3
OPAL 520 reagent pack	Akoya BioSciences	FP1487001KT	section 3
OPAL 570 reagent pack	Akoya BioSciences	FP1488001KT	section 3
OPAL 620 reagent pack	Akoya BioSciences	FP1495001KT	section 3
OPAL 690 reagent pack	Akoya BioSciences	FP1497001KT	section 3
OPAL 780 reagent pack	Akoya BioSciences	FP1501001KT	section 3
Opal 7-Color Automation IHC Kit 50 slide	Akoya BioSciences	NEL821001KT	section 3
PhenoChart 1.1.0	Akoya BioSciences	-	section 5
PhenoImagerHT	Akoya BioSciences	CLS143455	section 4, digital pathology imager with slide viewer and imaging software (formerly known as Vectra Polaris)
Quick-D mounting medium	Klinipath	7280	section 2
QuPath 0.3.2			whole slide image analysis software platform
R 4.1.1
Slide boxes	VWR	631-0737	section 1
SuperFrost Plus	Thermo Scientific through VWR	631-9483	section 1
Vectra Polaris software 1.0.13	Akoya BioSciences	-	section 4
Xylene	VWR	4055-9005	section 2