Dissection des ovaires, de l’intestin moyen et des glandes salivaires de moustiques pour l’analyse du microbiome au niveau des organes

Résumé

Les communautés microbiennes chez les moustiques sont très prometteuses pour les stratégies de biocontrôle vectoriel. La plupart des symbiotes sont incultivables et nécessitent des analyses métagénomiques. Nous décrivons une méthode pour disséquer les moustiques femelles et séparer les ovaires, l’intestin moyen et les glandes salivaires, en évitant la contamination croisée, en facilitant les études du microbiome au niveau des organes et en améliorant la compréhension des rôles des micro-organismes dans la biologie des moustiques.

Résumé

Le fardeau mondial des maladies transmises par les moustiques, notamment le paludisme, la dengue, le Nil occidental, le Zika, l’Usutu et la fièvre jaune, continue d’augmenter, ce qui constitue une menace importante pour la santé publique. Avec l’augmentation de la résistance aux insecticides et l’absence de vaccins efficaces, de nouvelles stratégies émergent qui se concentrent sur le microbiote du moustique. Néanmoins, la majorité des symbiotes restent résistants à la culture. La caractérisation de la diversité et de la fonction des génomes bactériens dans les spécimens de moustiques repose donc sur la métagénomique et les stratégies d’assemblage et de regroupement subséquentes. L’obtention et l’analyse de génomes assemblés par métagénome (MAG) à partir d’organes séparés peuvent notamment fournir des informations clés sur le rôle spécifique des microbes associés aux moustiques dans les ovaires (les organes reproducteurs), l’intestin moyen (clé pour la digestion des aliments et l’immunité) ou les glandes salivaires (essentielles pour la transmission des maladies à transmission vectorielle car les agents pathogènes doivent les coloniser pour pénétrer dans la salive et atteindre la circulation sanguine lors d’un repas sanguin). Ces génomes nouvellement reconstruits peuvent ensuite ouvrir la voie au développement de nouvelles stratégies de biocontrôle vectoriel. Pour ce faire, il est nécessaire d’isoler les organes des moustiques tout en évitant la contamination croisée entre eux ou avec des micro-organismes présents dans d’autres organes de moustiques. Nous décrivons ici un protocole de dissection optimisé et sans contamination pour étudier le microbiome des moustiques au niveau des organes.

Introduction

Les moustiques propagent un large éventail d’agents pathogènes causant des maladies et constituent une menace sérieuse pour la santé publique. En raison d’une prévalence accrue de la résistance aux insecticides parmi les populations de moustiques et en l’absence de vaccins efficaces contre ces agents pathogènes, de nouvelles méthodes de biocontrôle axées sur le microbiome des moustiques émergent. En particulier, la bactérie intracellulaire Wolbachia, qui peut interférer avec la transmission des agents pathogènes et manipuler la reproduction de l’hôte, se distingue ^1,2,3. De plus, d’autres symbiotes de moustiques sont essentiels à la survie, au développement ou au système immunitaire de leur hôte, ainsi qu’à l’infection et à la transmission d’agents pathogènes, et sont très prometteurs pour leur exploitation dans la lutte contre les maladies à transmission vectorielle 4,5,6,7,8.

Les micro-organismes associés aux moustiques couvrent tous les domaines de la vie microbienne (y compris les bactéries, les eucaryotes et les champignons) qui interagissent intimement avec leur hôte mais aussi les uns avec les autres dans les différents compartiments du corps ^9,10. Par conséquent, une meilleure compréhension du microbiote, de ses variations saisonnières potentielles¹¹ et des mécanismes par lesquels ses membres interagissent directement dans des tissus distincts de moustiques peut aider à développer de nouvelles méthodes de biocontrôle ciblées ou à améliorer celles existantes. Cependant, la majorité des symbiotes restent résistants à la culture, rendant leur caractérisation impossible.

L’avènement des méthodes de séquençage de deuxième et troisième générations, ainsi que des approches d’assemblage et de binning de pointe, ont permis de reconstruire les génomes microbiens et d’accéder à la diversité et au potentiel fonctionnel des microbes non cultivables. Ici, nous présentons une méthode de dissection des ovaires, de l’intestin moyen et des glandes salivaires des moustiques femelles tout en prévenant la contamination croisée. Ce protocole peut être suivi d’une extraction d’ADN génomique et d’un métacodage à barres ou d’un séquençage métagénomique ultérieur pour explorer la diversité et la fonction du microbiote des moustiques au niveau des organes. Nous fournissons un exemple de dissection de moustiques et de données sur le microbiome pour les spécimens de Culex spp., bien que ce protocole puisse être étendu à des vecteurs d’autres genres tels que Anopheles ou Aedes.

Protocole

REMARQUE : La figure 1 montre un schéma de la méthode résumant les différentes étapes du protocole.

1. Préparation du matériel

1. Avant de commencer l’expérience, préparez une solution d’eau de Javel avec 0,5% de chlore actif (recommandée par l’Organisation mondiale de la santé) pour désinfecter l’équipement et l’établi.
   1. Dans 900 mL d’eau, dissoudre trois comprimés solubles contenant chacun 1,5 g de chlore actif. Attendez 15 minutes pour que les pastilles se dissolvent complètement, ce qui donne une solution d’eau de Javel à 0,5 %.
   2. Placez la solution d’eau de Javel à 0,5 % dans un flacon pulvérisateur. Ensuite, vaporisez la solution sur tout l’équipement de dissection, y compris les lames microscopiques et l’établi.
      REMARQUE : L’équipement et l’établi doivent être laissés à sécher pendant ~10 min avant utilisation.
2. Pour rincer les moustiques avant chaque dissection afin d’éviter la contamination des échantillons par des bactéries externes, préparez quatre tubes de 1,5 mL nouvellement stérilisés : deux contenant de l’éthanol à 96 % et deux autres contenant 1 tampon PBS (solution saline tamponnée au phosphate).
3. Préparez les tubes pour stocker les échantillons après la dissection de chaque moustique : quatre tubes stériles de 1,5 mL, contenant chacun 100 μL de tampon de conservation.
   REMARQUE : Préparez un tube pour les glandes salivaires, un pour les ovaires, un pour l’intestin moyen et un pour la carcasse du moustique.

2. Collecte des moustiques

1. Prélever et garder en vie les femelles adultes (sur le terrain ou en laboratoire, 4 à 7 jours) jusqu’à la stérilisation en surface.

3. Stérilisation de surface des moustiques

REMARQUE : Nettoyez les pinces et les aiguilles et utilisez des tubes neufs et stérilisés entre chaque organe et individu. Si vous n’avez pas accès à de l’eau de Javel, assurez-vous de bien stériliser à la flamme la pince et les aiguilles de dissection entre chaque individu et chaque organe pour éviter la contamination croisée du matériel biologique. Les instruments de dissection doivent être secs, sans aucun résidu d’eau de Javel ou d’éthanol, avant la prochaine utilisation.

1. Pour éviter que les femelles ne vident leur contenu intestinal lorsqu’elles sont exposées à l’alcool, anesthésiez-les froidement sur de la glace ou dans un congélateur à -20 °C (pendant 4 min pour que les tissus et les organes ne gèlent pas).
2. Transférez les moustiques individuels dans un nouveau tube stérilisé de 1,5 ml contenant 1 ml d’éthanol à 96 %. Agitez doucement (manuellement) pendant 30 s (secouez bien le moustique dans le tube pour détacher les écailles et les contaminants bactériens potentiels à la surface des insectes). Rincer deux fois à l’aide de tubes contenant de l’éthanol.
3. Transférez le moustique dans un nouveau tube stérilisé de 1,5 mL avec 1 mL de solution stérile 1x PBS et agitez doucement (manuellement) pendant 30 s (pour éviter la précipitation de l’ADN avec de l’éthanol). Rincer deux fois à l’aide de tubes contenant 1x PBS stérile.

4. Dissection des moustiques

1. Placez plusieurs petites gouttes de 1x PBS stérile sur la lame pour faciliter le placement du moustique et le rinçage des organes disséqués.
   REMARQUE : Les gouttes de PBS stérile doivent être suffisamment grandes pour accueillir les organes du moustique.
2. Prenez le moustique nettoyé et placez-le sur une goutte de PBS stérile 1x sur la lame du microscope.
3. Disséquez les glandes salivaires à l’aide d’une pince et d’une aiguille stérilisées comme décrit ci-dessous.
   1. Tenez le thorax du moustique avec une pince à épiler pour l’empêcher de bouger. Ensuite, placez une aiguille au niveau du cou, sous la tête, et tirez doucement sur la tête du moustique pour la séparer du thorax.
      REMARQUE : Les glandes salivaires sont situées dans la partie supérieure du thorax et sont reliées à la tête par le canal salivaire. Lors de la dissection, il est crucial de ne pas casser ce conduit car les glandes salivaires ne viendront pas avec la tête lorsque vous la retirerez du thorax. C’est pourquoi il est important d’avoir un moustique frais, pas un moustique congelé.
   2. Lorsque la tête se sépare du thorax, observez l’émergence des deux glandes salivaires, chacune composée de trois lobes. Coupez les glandes salivaires au niveau du canal salivaire, récupérez-les à l’aide d’une aiguille et placez-les dans une nouvelle goutte de PBS stérile 1x pour la rincer et prévenir les contaminations inter-organes.
   3. Récupérez les glandes salivaires à l’aide d’une aiguille et placez-les dans un nouveau tube stérilisé contenant 100 μL de tampon de conservation.
4. Disséquez les ovaires à l’aide d’une pince et d’une aiguille stérilisées comme suit.
   1. Placez le moustique sur son dos. À l’aide d’une pince pour tenir le moustique par le thorax afin d’empêcher tout mouvement pendant la dissection, percez le troisième segment abdominal (en commençant par le bas) avec une aiguille.
      REMARQUE : En option, retirez les pattes et les ailes du moustique pour faciliter la dissection.
   2. Tout en perçant le troisième segment abdominal, tirez vers le bas pour l’ouvrir et révéler les organes internes. Retirez tous les morceaux restants de l’exosquelette du moustique pour faciliter la libération des organes.
      REMARQUE : Les organes de l’abdomen tels que l’intestin, les tubules de Malpighi et les ovaires sont visibles.
   3. Prélevez les deux ovaires à l’aide d’une pince stérilisée et placez-les dans une nouvelle goutte de PBS stérile 1x sur la lame de microscope pour les rincer. Saisissez les ovaires et placez-les dans le tube de 1,5 ml avec les 100 μL de tampon de conservation.
5. Maintenant que l’abdomen est ouvert et que les organes sont exposés, récupérez l’intestin moyen à l’aide d’une nouvelle pince et/ou d’une aiguille stérilisée.
   1. Séparez l’intestin moyen de l’intestin antérieur et de l’intestin postérieur ; ensuite, retirez les tubules de Malpighi de l’intestin moyen. Saisissez l’intestin moyen à l’aide d’une aiguille stérile et placez-le sur une nouvelle goutte stérile 1x PBS pour le rincer et prévenir les contaminations inter-organes.
   2. Transférer dans une nouvelle goutte stérile 1x PBS. Ouvrez l’intestin moyen avec une pince pour libérer et enrichir les bactéries comme décrit dans le fichier supplémentaire 1. Saisissez l’intestin moyen à l’aide d’une pince et pipetez tous les PBS contenant des bactéries pour stocker l’ensemble du matériel (liquide et tissu) dans un nouveau tube stérilisé de 1,5 ml avec 100 μL de tampon de conservation.
   3. Ajoutez à nouveau 5 μL de PBS 1x à l’endroit précédemment utilisé dans la lame de microscope et pipetez directement le PBS dans le même tube de 1,5 mL pour récupérer les bactéries qui auraient pu coller à la lame de microscope.
6. À l’aide d’une pince stérile, saisissez la carcasse (corps restant) et rangez-la dans un nouveau tube stérilisé de 1,5 mL avec 100 μL de tampon de conservation.
7. Stockage du matériel jusqu’à la suite du traitement
   1. Étiquetez les tubes avec « Espèce, Orgue, Date, Nom du chercheur ».
   2. Conservez les ovaires, l’intestin moyen, les glandes salivaires et la carcasse disséqués à -20 °C jusqu’à la transformation.
8. Gardez une trace dans une feuille de calcul de toutes les métadonnées associées aux échantillons, y compris l’espèce (ou le niveau du genre seulement), la date de collecte, le pays, la province, la latitude, la longitude, le nom de la personne qui a fait la dissection, la femelle gravide ou non, le repas de sang ou non.

Discussion

Nous vous recommandons de porter une attention particulière à la séquence de dissection de l’organe, en commençant par les glandes salivaires. En effet, nous avons observé qu’ils étaient plus facilement extraits du thorax des spécimens de Culex si l’intégrité du moustique était préservée. Des dommages à l’abdomen ou au thorax pourraient réduire la pression dans le corps du moustique, entravant la procédure. Cependant, il est également possible de couper entre le thorax et l’abdomen puis d’extraire les glandes salivaires de la tête et du thorax (A. B. Failloux, communication personnelle). De plus, il peut être difficile d’acquérir des compétences de dissection, c’est pourquoi nous vous suggérons de vous entraîner sur un nombre adéquat d’échantillons avant l’expérience.

Isoler les organes des moustiques tout en évitant la contamination croisée de manière systématique est crucial pour un large éventail d’analyses du microbiote des moustiques en aval. Une étude métagénomique résolue par le génome suite à la dissection d’ovaires uniques de spécimens de Culex pipiens dans le sud de la France a permis de découvrir le premier plasmide de Wolbachia chez Culex pipiens (pWCP¹⁴). En utilisant une approche similaire, nous avons étudié la distribution et la fréquence de la pWCP chez les spécimens de Culex pipiens et de Culex quinquefasciatus provenant de zones continentales et insulaires du monde entier, dans diverses conditions environnementales et de laboratoire. Dans l’ensemble, les données ont révélé un élément plasmidique Wolbachia remarquablement conservé chez les moustiques Culex , suggérant un rôle crucial pour cet élément mobile dans la biologie des endosymbiotes¹⁵, justifiant une analyse plus approfondie.

Nous fournissons ici d’autres exemples d’analyses du microbiome des moustiques sur des échantillons d’intestin moyen et d’ovaire obtenus à l’aide de cette procédure systématique. Nous avons observé une nette différence de microbiote entre les tissus (Figure 5), avec des taxons bactériens communs et spécifiques à un organe. Comme prévu, la présence de Wolbachia a été détectée dans les deux organes, avec une abondance relative plus élevée (basée sur de courtes lectures non assemblées) et une couverture moyenne des MAG dans les ovaires des moustiques par rapport aux intestins moyens, ce qui correspond à l’observation selon laquelle cet endosymbiote est transmis par les ovaires et se propage ensuite aux tissus somatiques. Bien que cette étude ait été limitée à des échantillons de Nouvelle-Calédonie, ce protocole pourrait faciliter l’étude de la variabilité génomique de Wolbachia à l’échelle mondiale, ainsi que de son rôle dans divers phénotypes, y compris la régulation de la densité et la protection virale. De plus, ce travail illustre comment la procédure de dissection présentée ici permet d’examiner la diversité taxonomique et les capacités fonctionnelles potentielles des symbiotes de moustiques dans des échantillons d’intestin moyen.

Nous avons obtenu deux ébauches de génomes entérobactériens qui n’étaient présentes que dans deux échantillons d’intestin moyen, confirmant l’absence de contamination entre les organes pour ces deux échantillons. En ce qui concerne les spirochètes, détectés à la fois dans l’intestin moyen et les ovaires de l’individu 3, Juma et ses collègues ont observé en 2020 la présence de ces bactéries à la surface des radeaux d’œufs. Les auteurs ont suggéré que les communautés bactériennes trouvées dans les radeaux d’œufs pourraient être principalement héritées de la mère des ovaires, étant donné que les radeaux d’œufs étaient conservés dans de l’eau désionisée et exempte de bactéries. Cependant, ils n’ont pas pu exclure la possibilité d’une colonisation bactérienne juste après la ponte et ont recommandé une étude plus approfondie sur le microbiome ovaire¹⁶.

Bien qu’initialement conçu pour des spécimens du complexe d’espèces Culex pipiens , nous prévoyons l’applicabilité de ce protocole à une communauté plus large d’entomologistes médicaux étudiant d’autres vecteurs tels que les anophèles ou les aedes. En opérant au niveau des organes individuels, cette méthode peut permettre des comparaisons génomiques intra et interindividuelles, offrant des informations sur la variabilité génomique des symbiotes à une petite échelle, avec le potentiel de faire progresser les stratégies de lutte antivectorielle. Cette méthode de dissection et d’isolement des glandes salivaires, des ovaires et de l’intestin moyen, prévenant la contamination croisée microbienne, pourrait également être un protocole utile pour les études de dynamique des infections virales au sein de ces trois organes.

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alcohol 96°	Fisher scientific	10332562
Binocular magnifier
Bleach	RAJA	145517	150 tablets of 1.5 g
DNA prep kit	Illumina	Provided by MGX sequencing platform	Previously known as Nextera DNA Flex
DNA-RNA Shield (50 mL)	Zymo research	ZR1100-50	Preservation buffer
DNeasy Blood and Tissue Kit	Qiagen	69504	DNA extraction kit
Filter tips 20 µL	Starlab	S1120-3810
Filter tips 200 µL	Starlab	S1120-8710
Filter tips 1000 µL	Starlab	S1122-1730-C
Forceps	FST (Fine Science Tools)	11252-20	Dumont Forceps #5
Library quantification kit	Roche	Provided by MGX sequencing platform	KAPA Library Quanitification Kits
Micropipettes 2-20 µL	Eppendorf	6.291704
Micropipettes 20-200 µL	Eppendorf	6.291703
Micropipettes 100-1000 µL	Eppendorf	7.648488
Microscope slides	Epredia	J1800BMNZ	dimension : 75 mm x 50 mm
Needles	Terumo	AN*2719R1
NGS kit	Agilent	Provided by MGX sequencing platform	Fragment Analyzer Systems HS Genomic DNA 50kb Kit
NovaSeq 6000	Illumina	Provided by MGX sequencing platform	Sequencer
PBS Phosphate Buffered Saline (Sterile)	Fisher scientific	10212990
Permanent black marker
Sterile Eppendorf	Dutscher	33871	1.5 mL
Support for needles	FST (Fine Science Tools)	26016-12	Moria MC1 Pin Holder 12 cm