Organoïdes intestinaux porcins bidimensionnels reflétant les propriétés physiologiques de l’intestin natif

Résumé

Cette étude décrit un protocole pour générer des monocouches 2D d’organoïdes porcins dérivés de l’intestin grêle et du gros intestin. La croissance de ces monocouches est marquée par l’augmentation des valeurs TEER, indiquant une intégrité épithéliale robuste. De plus, ces monocouches présentent des réponses sécrétoires physiologiques dans les expériences en chambre d’Ussing après l’application de forskoline.

Résumé

Le tractus gastro-intestinal (GIT) sert à la fois à la digestion des aliments et à l’absorption des nutriments, mais aussi à servir de barrière protectrice contre les agents pathogènes. Traditionnellement, la recherche dans ce domaine s’est appuyée sur des expériences sur des animaux, mais il existe une demande croissante pour des méthodes alternatives qui adhèrent aux principes des 3R : remplacer, réduire et affiner. Les organoïdes porcins sont apparus comme un outil prometteur, offrant une réplication in vitro plus précise des conditions in vivo que les modèles cellulaires traditionnels. L’un des principaux défis des organoïdes intestinaux est leur surface apicale tournée vers l’intérieur et leur surface basolatérale tournée vers l’extérieur. Cette limitation peut être surmontée en créant des couches organoïdes bidimensionnelles (2D) sur des inserts de transpuits (ci-après dénommés inserts), permettant d’accéder aux deux surfaces. Dans cette étude, nous avons réussi à développer des cultures bidimensionnelles d’organoïdes du jéjunum porcin et du côlon. Le processus de culture comporte deux phases clés : d’abord, la formation d’une monocouche cellulaire, suivie de la différenciation des cellules à l’aide de milieux adaptés. La croissance cellulaire est suivie en mesurant la résistance électrique transépithéliale, qui se stabilise au jour 8 pour les organoïdes du côlon et au jour 16 pour les organoïdes du jéjunum. Après une phase de différenciation de 2 jours, l’épithélium est prêt pour l’analyse. Pour quantifier et suivre les processus de transport électrogénique actifs, tels que la sécrétion de chlorure, nous utilisons la technique de la chambre d’Ussing. Cette méthode permet de mesurer en temps réel et de caractériser finement les processus de transport épithélial. Ce modèle in vitro innovant, combiné à des techniques établies comme la chambre d’Ussing, fournit une plate-forme solide pour caractériser physiologiquement le GIT porcin dans le cadre des 3R. Elle ouvre également des possibilités d’étudier les mécanismes physiopathologiques et de développer des stratégies thérapeutiques potentielles.

Introduction

Le GIT joue un rôle central dans la digestion, l’absorption des nutriments et l’excrétion des déchets par les matières fécales¹. De plus, il fonctionne comme une barrière contre les agents pathogènes, un rôle soutenu par une composition cellulaire diversifiée, y compris des cellules souches, des cellules caliciformes productrices de mucus, des cellules entéroendocrines et des entérocytes absorbants². L’homéostasie intestinale peut être perturbée par divers facteurs, tels que des infections bactériennes³ ou des processus inflammatoires⁴, entraînant de graves conséquences pour l’organisme, telles que la malabsorption, la diarrhée ou même la mort⁵. L’étude de tels scénarios physiopathologiques est couramment effectuée à l’aide d’animaux de laboratoire ou, conformément au principe^6R des 3R, de cultures cellulaires dérivées de diverses espèces. La prédiction précise et la transférabilité des résultats sont cruciales lors de l’utilisation de modèles spécifiques à une espèce⁷. Malgré ce besoin, il existe un manque notable de cultures de cellules dérivées de porcs qui reproduisent de manière adéquate la complexité et la fonctionnalité du tractus intestinal.

Pour relever ce défi, également pertinent pour d’autres espèces, des organoïdes tridimensionnels (3D) ont été développés dans le but de reproduire la complexité physiologique du GIT⁸. Initialement, les organoïdes ont été créés à partir d’intestins humains et de souris ; À ce jour, des organoïdes porcins provenant de porcs juvéniles et adultes ont également été développés et cultivés avec succès ^9,10. Depuis leur création, ces organoïdes porcins ont été utilisés dans plusieurs études, se concentrant principalement sur les infections intestinales 11,12,13,14. Les recherches visant à caractériser les propriétés physiologiques, telles que le transport des nutriments ou les processus sécrétoires, restent limitées¹⁵. Cela peut être dû à l’orientation des organoïdes intestinaux, la face apicale tournée vers l’intérieur et la face basolatérale vers l’extérieur, limitant l’accessibilité à la surface apicale. Cette limitation a été résolue par la culture réussie d’organoïdes porcins dans un format bidimensionnel¹⁶, une méthode qui a été perfectionnée grâce à l’utilisation de tissus congelés pour les générer¹⁷.

La culture 2D d’organoïdes porcins permet d’accéder aux deux côtés de l’épithélium, ce qui permet l’application de méthodes bien établies pour étudier les processus de transport à travers la couche épithéliale. L’une de ces méthodes est la chambre d’Ussing¹⁸, qui permet d’observer en temps réel les processus d’absorption et de sécrétion électrogéniques à travers l’épithélium. L’utilisation intensive de ce système a permis une compréhension complète de la fonction intestinale porcine in vivo, couvrant l’ensemble de l’axe intestinal. Cela comprend des études sur le transport des monosaccharides ou du transport des acides gras à chaîne courte ou les réponses aux métabolites végétaux secondaires tels que le resvératrol qui influencent les caractéristiques de transport intestinal 19,20,21,22,23,24. L’ensemble substantiel de données issues de ces études facilite les comparaisons directes entre les conditions in vivo bien caractérisées et l’environnement in vitro des organoïdes porcins, améliorant ainsi notre compréhension de leur pertinence physiologique.

Dans cette étude, nous présentons un protocole de génération et de culture de monocouches 2D à partir d’organoïdes porcins 3D. De plus, nous détaillons l’approche méthodologique pour quantifier les processus de transport intestinal à l’aide de la technique de la chambre d’Ussing. Le protocole offre des outils pour étudier les caractéristiques d’absorption et de sécrétion in vitro dans les organoïdes du jéjunum et du côlon, permettant une comparaison directe avec des conditions in vivo bien caractérisées. Les applications futures de ce protocole pourraient inclure l’étude des effets de substances pharmacologiques ou toxicologiques, ainsi que l’exploration des interactions entre l’épithélium et les agents pathogènes.

Protocole

Dans le cadre de ce protocole, deux porcs en bonne santé (1 mâle, 1 femelle, 4,5 mois, environ 65 kg) ont été sacrifiés par tir à percuteur et saignage. Selon la loi sur la protection des animaux, l’abattage et le prélèvement de tissus ne sont pas considérés comme une expérience sur les animaux, mais doivent être signalés au responsable du bien-être animal (n° d’enregistrement. TiHo-T-2023-15) de la Fondation de l’Université de médecine vétérinaire de Hanovre.

1. Revêtement des inserts

REMARQUE : Toutes les étapes sont effectuées avec des matériaux stériles sous une enceinte de sécurité. Toutes les étapes du protocole sont effectuées sur la glace, sauf indication contraire.

1. Décongeler la membrane basale gelée sur de la glace pendant au moins 1 h à température ambiante ou toute la nuit sur la glace à 4 °C. Mélangez la membrane basale 1:40 (v/v) avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) stérile glacée dans un tube conique.
2. Retirez les plaques stériles avec inserts de l’emballage. Ajouter 200 μL de mélange de membrane basale dans le compartiment apical de chaque insert.
3. Replacez le couvercle de la plaque du puits et incubez pendant au moins 1,5 h à 37 °C, 5 % de CO₂ dans un incubateur.
4. Aspirez soigneusement la solution avant d’ensemencer les cellules. Assurez-vous que l’embout ne touche pas la membrane pendant l’aspiration.

2. Génération de monocouches organoïdes 2D

REMARQUE : Les organoïdes du côlon porcin sont générés et cultivés comme décrit pour les organoïdes jéjunaux porcins²⁵. Après la génération d’organoïdes 3D, ceux-ci doivent être cultivés pendant au moins 3 à 4 semaines tout en passant chaque semaine pour assurer une croissance constante. Le nombre de cellules à l’intérieur de chaque dôme contenant des organoïdes 3D, qui sont dissous dans les étapes suivantes, est suffisant pour couvrir un seul filtre transmembranaire. Avant la génération de monocouches, les organoïdes 3D ont été soumis à un contrôle de qualité optique pour vérifier la croissance précédente et une éventuelle contamination (Figure 1).

Figure 1 : Organoïdes 3D représentatifs. Les organoïdes tridimensionnels du jéjunum (A) et du côlon (B) sont soigneusement examinés au microscope avant de générer des monocouches. Une attention particulière est accordée à l’évaluation des modèles de croissance antérieurs, de l’intégrité structurelle et de la présence d’impuretés ou de contamination. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

1. Retirez le milieu organoïde (tableau 1) des puits avec des organoïdes de crypte 3D. Ajouter 1 mL de PBS glacé par puits et dissoudre doucement la membrane basale en pipetant de haut en bas avec une pointe p1000.
2. Prélever tous les organoïdes dissous dans un tube de 15 mL pré-rempli de 10 mL de PBS glacé. Centrifuger le tube à 250 x g, 10 min à 4 °C. Aspirez le surnageant.
3. Remettre la pastille en suspension dans 1 mL de trypsine/EDTA tiède à 0,05 % (v/v) (37 °C) (2 tubes peuvent être regroupés à ce stade). Incuber pendant 5 min à 37 °C dans un bain-marie et mettre directement sur de la glace par la suite pour arrêter la réaction.
4. Resuspendez-le sur la glace 20x avec l’embout p1000, et encore 15x avec l’embout p1000 + l’embout p200 sur le dessus. Ajouter 10 ml de DMEM glacé complété par 10 % (v/v) de sérum de veau fœtal (SCA).
5. Tube de centrifugation à 1 000 x g, 10 min à 4 °C. Jeter le surnageant et remettre la pastille en suspension dans 1 mL de milieu monocouche (tableau 1).
6. Déterminez le nombre de cellules vivantes par ml à l’aide d’une chambre Neubauer conformément aux instructions du fabricant.
7. Retirer la solution d’enrobage à ce stade du compartiment apical et la remplacer par 500 μL de milieu monocouche chaud (37 °C). Ajouter 3 mL de milieu monocouche dans le compartiment basolatéral.
8. Déterminez la résistance à vide (TEER) de chaque insert de transpuits vide, comme décrit en détail à l’étape 3. Le temps pendant lequel aucun milieu n’est présent dans la chambre apicale doit être aussi court que possible pour éviter que les cellules ne se dessèchent.
9. Retirer le milieu monocouche apical et ajouter pour la culture 2D jéjunale 2 x 10⁵ cellules épithéliales et pour la culture 2D colique 1,5 x 10⁵ cellules épithéliales dans 500 μL de milieu monocouche dans la chambre apicale de chaque puits de transwell.
10. Changez de support et mesurez FEER tous les 2-3 jours. Mesurez FEER avant de changer de support. Aspirer soigneusement le milieu du compartiment apical et basal et le remplacer par 500 μL ou 3 mL de milieu frais et chaud (37 °C).
    1. Pour les organoïdes du jéjunum : au 16e jour, après l’ensemencement, passer d’un milieu monocouche à un milieu de différenciation (tableau 1). Pour les organoïdes du côlon : changer de milieu le jour 7 pour un milieu de différenciation.
11. Changez le milieu de différenciation tous les jours et effectuez une mesure TEER à chaque changement de milieu. Le jour 18 (pour les organoïdes jéjunaux) ou le jour 9 (pour les organoïdes du côlon), après l’ensemencement, procédez aux expériences fonctionnelles.

3. Mesure de la résistance électrique transépithéliale (TEER)

REMARQUE : Toutes les mesures sont effectuées sous une enceinte de sécurité pour éviter toute contamination. Avant l’ensemencement des cellules, chaque puits enduit vide est mesuré pour obtenir des valeurs de vide individuelles. Le voltmètre-ohmmètre stocke les valeurs sur un périphérique USB introduit.

1. Nettoyez l’électrode de la baguette avec de l’éthanol à 70 % (v/v) et laissez l’électrode sécher complètement. Pendant ce temps, retirez la plaque de l’incubateur et placez-la sous l’armoire.
2. Introduisez le bras court de l’électrode de baguette dans le compartiment apical des inserts et le bras long dans le compartiment basolatéral de l’insert. Évitez le contact du bras court avec la couche cellulaire.
3. Mesurez la résistance électrique transépithéliale de chaque transpuits. Laissez le voltmètre-ohmmètre s’équilibrer pour assurer une mesure stable. Mesurez les valeurs TEER en cliquant sur le bouton Store.
4. Continuez les étapes 3.2 et 3.3 avec les puits restants. Après avoir atteint le dernier puits, le voltmètre-ohmmètre ouvre une demande de stockage des données sur un périphérique USB. Cliquez sur Enregistrer.
5. Nettoyez l’électrode après chaque plaque et à la fin de la mesure et laissez-la sécher complètement avant de la ranger.
6. Soustrayez les valeurs vides déterminées avant l’ensemencement des cellules des valeurs cellulaires mesurées.

4. Etudes de transport électrophysiologique à l’aide de la technique de la chambre d’Ussing

REMARQUE : La détermination des études de transport électrophysiologique est effectuée à l’aide d’une chambre d’Ussing composée de deux compartiments de chambre, qui sont divisés par l’épithélium. Cette chambre est reliée à une pince de tension par des électrodes Ag/AgCl. Cette technique permet de suivre les processus de transport électrogénique actif de l’épithélium à travers les modifications du courant de court-circuit (I_sc) induites par la pince de tension ainsi que la résistance tissulaire (R_t) calculée par la loi d’Ohm. I_sc et R_t sont enregistrés toutes les 6 s pendant toute la durée de l’expérience. Au cours de l’expérience, les tissus étudiés sont aérés avec du carbogène et incubés avec des solutions Krebs-Henseleit modifiées pour garantir des conditions viables. L’indométacine (10 μM) est ajoutée aux solutions tampons pour inhiber la synthèse des prostaglandines²⁶.

1. Réchauffer les solutions tampons muqueuses et séreuses à 37 °C et aérer avec du carbogène. Assemblez les chambres individuelles à l’aide d’un insert vide pour chaque chambre individuelle. Assurez-vous que les côtés apicaux des puits sont tous orientés dans la même direction.
2. Remplissez toutes les chambres avec 5 mL de solution tampon muqueuse préchauffée (tableau 2). Connectez toutes les électrodes de la pince de tension aux chambres individuelles conformément aux instructions du fabricant. Assurez-vous qu’aucune bulle de gaz n’interfère avec les électrodes pour assurer une mesure correcte.
3. Calibrez le logiciel de la chambre d’utilisation dans ces conditions en cliquant sur le bouton Rf/dpI dans le logiciel de pince de tension. La résistance de tous les inserts vides utilisés doit être égale (~ 70 Ohm) et le courant doit être d’environ 0 mV (± 5 mV). Si ce n’est pas le cas pour certaines chambres, vérifiez le bon placement des électrodes ou des bulles dans le système.
4. Retirez toutes les électrodes et jetez la solution tampon utilisée. Ouvrez toutes les chambres individuelles et retirez les inserts vides. Assurez-vous que l’ordre des différentes chambres est maintenu.
5. Déplacez la plaque de puits avec les inserts de l’incubateur vers l’armoire de sécurité. Aspirez soigneusement le milieu basolatéral et apical.
6. Laver les cellules en ajoutant 500 μL de tampon muqueux chaud (37 °C) dans la chambre apicale et 3 ml de tampon sérosal, dans la chambre basolatérale. Aspirez les tampons et répétez l’opération 2 fois.
7. Retirez les inserts de la plaque. Retirez délicatement les supports des inserts. Placez les inserts dans les chambres Ussing et assurez-vous que l’orientation des inserts est la même que lors de la phase d’étalonnage. Assemblez les chambres individuelles comme illustré à la figure 2.
8. Remplissez les chambres faisant face à la face basolatérale des cellules avec 5 mL de tampon sérosal, (tableau 2) et la chambre faisant face à la chambre apicale avec 5 mL de tampon muqueux.
9. Connectez les électrodes et les tubes d’aération à chaque chambre individuelle. Démarrez la mesure dans le logiciel Ussing. Laisser l’équilibre pendant 15 min.
10. Changez les conditions d’un circuit ouvert à des conditions de court-circuit. Équilibrez pendant 5 min à 10 min. Ajouter 10 μM de forskoline dans la chambre séreuse.
    REMARQUE : L’ajout de forskoline peut être remplacé par d’autres agents/substances en fonction des segments intestinaux individuels et des questions de recherche.
11. Après 15 minutes, ajoutez plus d’agents de la même manière que la forskoline ou arrêtez la mesure. Retirez les tubes d’aération et les électrodes des chambres individuelles. Versez les solutions tampons des deux chambres dans un bol.
12. Démontez les chambres et jetez les inserts ou utilisez-les pour une analyse de suivi (p. ex., immunohistochimie ou analyse d’expression)

Figure 2 : Structure schématique de la chambre d’Ussing. Les deux chambres sont divisées par la membrane avec la monocouche 2D cultivée. Les deux chambres sont aérées au carbogène ; La tension et le courant sont surveillés par deux électrodes par chambre. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

5. Analyse des données générées par la configuration de la chambre Ussing

1. Importez les données générées par le logiciel de pince de tension dans un éditeur de tableur approprié.
2. Pour déterminer les valeurs basales I_sc et R_t , calculez la moyenne de 10 points de données consécutifs pris 10 min après l’initialisation des conditions de court-circuit. Chaque chambre individuelle sert de réplique technique, tandis que chaque passage d’organoïdes sert de réplique biologique.
3. Pour évaluer les effets des agents appliqués, calculez la moyenne de 10 points de données consécutifs immédiatement avant l’ajout de l’agent. Comparez cette moyenne à la valeur maximale (ou minimale) observée après l’application de l’agent. Les données obtenues sont présentées sous forme de moyenne ± d’écart-type (ET).

Résultats

Ce protocole facilite la génération fiable de monocouches 2D porcines en désagrégeant des organoïdes 3D dérivés du jéjunum et du côlon des porcs. Sur une période de culture de 16 jours pour les organoïdes du jéjunum et de 9 jours pour les organoïdes du côlon, des monocouches intactes se forment. Ces monocouches peuvent ensuite être utilisées pour évaluer les propriétés de transport électrogéniques et physiologiques à l’aide de la technique de la chambre d’Ussing...

Discussion

Ce protocole décrit une méthode pour convertir des organoïdes 3D porcins établis en cellules uniques, qui sont ensuite ensemencées sur des membranes transpuits pour former une monocouche intacte. Cette configuration permet d’accéder à la face apicale des cellules, facilitant l’utilisation des chambres d’Ussing pour surveiller les processus d’absorption et de sécrétion.

L’étape initiale et cruciale de ce processus en plusieurs étapes est la...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
24 well plate	SARSTEDT AG & Co. KG	8,33,922
A83-01	MedChemExpress, New Jersey, USA	HY-10432	Store at -20 °C. Thaw when needed
accujet S	Brand GmbH + Co KG, Wertheim, Germany	26351
Advanced DMEM/F12 Medium	Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA	12634010	Store at 4 °C
B27 supplement	Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA	17504044	Store at -20 °C. Thaw when needed
CaCl2.2 H2O	Merck KGaA, Darmstadt, Germany	C3306	Store at room temperature
D(+)-Glucose (wasserfrei)	Merck KGaA, Darmstadt, Germany	1.08337	Store at room temperature
DAPT	MedChemExpress, New Jersey, USA	HY-13027	Store at -20 °C. Thaw when needed
D-Mannitol	Merck KGaA, Darmstadt, Germany	M4125	Store at room temperature
DMSO	Sigma-Aldrich, Schnelldorf, Germany	154938	Store at room temperature
Electrode-Set (AgCl/PtIr/Std.)	Scientific Instruments, Simmerath, Germany	#1316
Eppendorf Research plus	Eppendorf SE, Hamburg, Gemany	3123000063
Eppendorf Research plus	Eppendorf SE, Hamburg, Gemany	3123000047
EVOM3 Manual Epithelial Volt Ohm Meter	World precision instruments, Sarasota, USA	EVM-MT-03-01
FBS	Sigma-Aldrich, Schnelldorf, Germany	F7524	Store at -20 °C. Thaw when needed
Forskolin	Sigma-Aldrich, Schnelldorf, Germany	F6886	Store at -20 °C. Thaw when needed
gasprofi 1 SCS micro	WLD-TEC GmbH, Arsenhausen, Germany	60,04,000
Gastrin 1	MedChemExpress, New Jersey, USA	HY-P1097	Store at -20 °C. Thaw when needed
Glutamax	Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA	35050061	Store at 4 °C.
HCl	Sigma-Aldrich, Schnelldorf, Germany	1090571000	Store at room temperature
HEPES	Sigma-Aldrich, Schnelldorf, Germany	H0887	Store at 4 °C
Herasafe 2025 Class II Biological Safety Cabinet	Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA	51033316
Incubator ICO105	Memmert GmbH + Co.KG, Schwabach, Germany	62,20,143
Indomethacin	Merck KGaA, Darmstadt, Germany	I7378	Store at room temperature
KCl	Merck KGaA, Darmstadt, Germany	1.04936	Store at room temperature
L-Glutamin	Sigma-Aldrich, Schnelldorf, Germany	G7513	Store at -20 °C. Thaw when needed
LWRN Supernatant	selfmade		Store at -20 °C. Thaw when needed. LWRN supplement is produced according to Miyoshi et al. (2012)
Matrigel Basement Membrane Matrix, LDEV-free, 10 mL	Corning Incorporated - Life Sciences	354234	Store at -20 °C. Thaw carefully on ice when needed
Megafuge 1.OR	Heraeus Instruments, Osterode, Germany	75003060
MgCl2.6 H2O	Merck KGaA, Darmstadt, Germany	1.05833	Store at room temperature
Na2HPO4.2H2O	Merck KGaA, Darmstadt, Germany	1.06580	Store at room temperature
N-Acetyl-L-cysteine	Sigma-Aldrich, Schnelldorf, Germany	A7250	Store at -20 °C. Thaw when needed
NaCl	Merck KGaA, Darmstadt, Germany	1.06404	Store at room temperature
NaH2PO4.H2O	Merck KGaA, Darmstadt, Germany	1.06346	Store at room temperature
NaHCO3	Merck KGaA, Darmstadt, Germany	1.06329	Store at room temperature
Neubauer improved chamber	Glaswarenfabrik Karl Hecht, Sondheim vor der Rhön, Germany	40442712
Olympus IX70 iverted Microscope	Olympus Corporation, Hamburg, Germany
Pen/Strep	Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA	15140122	Store at -20 °C. Thaw when needed
PolymyxinB	Sigma-Aldrich, Schnelldorf, Germany	P4932-1MU	Store at -20 °C. Thaw when needed
Primovert microscope stand with binocular phototube	Zeiss	415510-1101-000
rm EGF	Prepotech, New Jersey, USA	315-09	Store at -20 °C. Thaw when needed
SB202190	MedChemExpress, New Jersey, USA	HY-10295	Store at -20 °C. Thaw when needed
Snapwell 3801	Corning Incorporated - Life Sciences	3801
Trypsin/EDTA	Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA	25300054
Ussing Base System	Scientific Instruments, Simmerath, Germany	#1317
Ussing Diffusion Chamber	Scientific Instruments, Simmerath, Germany	SKU 1307
Voltage/Current Clamp VCC6	Scientific Instruments, Simmerath, Germany	SKU 1310
Y27632	MedChemExpress, New Jersey, USA	HY-10583	Store at -20 °C. Thaw when needed