Двумерные органоиды кишечника свиньи, отражающие физиологические свойства нативного кишечника

Резюме

В этом исследовании изложен протокол создания двумерных монослоев органоидов свиньи, полученных из тонкого и толстого кишечника. Рост этих монослоев характеризуется увеличением значений TEER, что указывает на устойчивую целостность эпителия. Кроме того, эти монослои проявляют физиологические секреторные реакции в экспериментах в камере Уссинга после применения форсколина.

Аннотация

Желудочно-кишечный тракт (ЖКТ) служит не только для переваривания пищи и усвоения питательных веществ, но и в качестве защитного барьера от патогенов. Традиционно исследования в этой области опирались на эксперименты на животных, но растет спрос на альтернативные методы, которые придерживаются принципов 3R — замена, сокращение и совершенствование. Органоиды свиней стали многообещающим инструментом, предлагающим более точную репликацию in vitro условий in vivo , чем традиционные клеточные модели. Одной из основных проблем кишечных органоидов является их обращенная внутрь апикальная поверхность и обращенная наружу базолатеральная поверхность. Это ограничение может быть преодолено путем создания двумерных (2D) органоидных слоев на трансвелловых вставках (далее именуемых вставками)), обеспечивающих доступ к обеим поверхностям. В этом исследовании мы успешно разработали двумерные культуры органоидов тощей кишки свиньи и толстой кишки. Процесс культивирования включает в себя два ключевых этапа: во-первых, формирование клеточного монослоя с последующей дифференцировкой клеток с помощью специализированных сред. Клеточный рост отслеживается путем измерения трансэпителиального электрического сопротивления, которое стабилизируется к 8-му дню для органоидов толстой кишки и 16-му дню для органоидов тощей кишки. После 2-дневной фазы дифференцировки эпителий готов к анализу. Для количественной оценки и отслеживания активных электрогенных транспортных процессов, таких как секреция хлоридов, мы используем метод камеры Уссинга. Этот метод позволяет проводить измерения в режиме реального времени и подробно характеризовать процессы переноса эпителия. Эта инновационная модель in vitro в сочетании с признанными методами, такими как камера Уссинга, обеспечивает надежную платформу для физиологической характеристики желудочно-кишечного тракта свиньи в рамках 3R. Это также открывает возможности для исследования патофизиологических механизмов и разработки потенциальных терапевтических стратегий.

Введение

ЖКТ играет центральную роль в пищеварении, усвоении питательных веществ и выведении отходов через кал¹. Кроме того, он функционирует как барьер против патогенов, и эта роль поддерживается разнообразным клеточным составом, включая стволовые клетки, бокаловидные клетки, продуцирующие слизь, энтероэндокринные клетки и абсорбционные энтероциты2. Гомеостаз кишечника может быть нарушен различными факторами, такими как бактериальные инфекции³ или воспалительные процессы⁴, что приводит к тяжелым последствиям для организма, таким как мальабсорбция, диарея или даже смерть⁵. Исследование таких патофизиологических сценариев обычно проводится с использованием лабораторных животных или, в соответствии с принципом⁶ 3R, клеточных культур, полученных от различных видов. Точное прогнозирование и переносимость результатов имеют решающее значение при использовании видоспецифичных моделей⁷. Несмотря на эту потребность, существует заметная нехватка клеточных культур, полученных из свиньи, которые адекватно воспроизводят сложность и функциональность кишечного тракта.

Для решения этой проблемы, также актуальной для других видов, были разработаны трехмерные (3D) органоиды в попытке воспроизвести физиологическую сложность ЖКТ⁸. Первоначально органоиды создавались из кишечника человека и мышей; На сегодняшний день также успешно выведены и культивированы органоиды свиней от молоди и взрослых свиней ^9,10. С момента своего создания эти свиные органоиды использовались в нескольких исследованиях, в первую очередь посвященных кишечным инфекциям 11,12,13,14. Исследования, направленные на характеристику физиологических свойств, таких как транспорт питательных веществ или секреторные процессы, остаются ограниченными¹⁵. Это может быть связано с ориентацией кишечных органоидов, при этом апикальная поверхность обращена внутрь, а базолатеральная сторона наружу, что ограничивает доступ к апикальной поверхности. Это ограничение было устранено путем успешного культивирования органоидов свиней в двумерном формате¹⁶, метод, который был усовершенствован за счет использования замороженных тканей для их получения¹⁷.

2D-культивирование органоидов свиньи обеспечивает доступ к обеим сторонам эпителия, что позволяет применять хорошо зарекомендовавшие себя методы для изучения процессов переноса через эпителиальный слой. Одним из таких методов является камера^{Уссинга 18}, которая позволяет в режиме реального времени наблюдать за электрогенными абсорбционными и секреторными процессами в эпителии. Широкое использование этой системы обеспечило всестороннее понимание функции кишечника свиньи in vivo, охватывающее всю кишечную ось. Это включает в себя исследования транспорта моносахаридов или короткоцепочечных жирных кислот или реакции на вторичные растительные метаболиты, такие как ресвератрол, которые влияют на характеристики кишечного транспорта 19,20,21,22,23,24. Значительный объем данных этих исследований позволяет проводить прямые сравнения между хорошо охарактеризованными in vivo условиями и средой in vitro свиных органоидов, улучшая наше понимание их физиологической значимости.

В этом исследовании мы представляем протокол создания и культивирования 2D-монослоев из 3D-органоидов свиней. Кроме того, мы подробно описываем методологический подход к количественной оценке процессов кишечного транспорта с использованием техники камеры Уссинга. Протокол предлагает инструменты для изучения абсорбционных и секреторных характеристик in vitro в органоидах тощей кишки и толстой кишки, что позволяет проводить прямое сравнение с хорошо охарактеризованными условиями in vivo . Будущие применения этого протокола могут включать исследование эффектов фармакологических или токсикологических веществ, а также изучение взаимодействий между эпителием и патогенами.

протокол

Для этого протокола две здоровые свиньи (черная пестрая свинья Бентхайма; 1 самец, 1 самка; возраст 4,5 месяца; около 65 кг) были принесены в жертву путем выстрела в неволю и обескровливания. Согласно Закону о защите животных, это (убой и изъятие тканей) не классифицируется как эксперимент на животных, но должно быть сообщено инспектору по защите животных (регистрационный номер. TiHo-T-2023-15) Университета ветеринарной медицины Ганноверского фонда.

1. Нанесение покрытий на вкладыши

ПРИМЕЧАНИЕ: Все этапы выполняются с использованием стерильных материалов под защитным шкафом. Все этапы протокола выполняются на льду, если не указано иное.

1. Замерзшую базальную мембрану разморозьте на льду не менее 1 часа при комнатной температуре или в течение ночи на льду при температуре 4 °C. Смешайте базальную мембрану в соотношении 1:40 (v/v) с ледяным стерильным фосфатно-солевым буфером (PBS) в конической пробирке.
2. Извлеките стерильные пластины со вкладышами из упаковки. Добавьте 200 мкл смеси базальной мембраны в апикальный отсек каждой вставки.
3. Установите на место крышку луночного колодца и инкубируйте в инкубаторе не менее 1,5 ч при 37 °C, 5%_CO2 .
4. Тщательно отсадите раствор перед затравливанием клеток. Следите за тем, чтобы наконечник не касался мембраны во время аспирации.

2. Генерация монослоев 2D органоидов

ПРИМЕЧАНИЕ: Органоиды толстой кишки свиньи получают и культивируют так, как описано для органоидов тощей кишки свиней²⁵. После получения 3D органоидов их следует культивировать в течение как минимум 3-4 недель с еженедельным пассажем для обеспечения стабильного роста. Количество ячеек внутри каждого купола, содержащих 3D-органоиды, которые растворяются на последующих стадиях, достаточно для покрытия одного трансмембранного фильтра. Перед созданием монослоя 3D-органоиды подвергали оптическому контролю качества для проверки предыдущего роста и возможного загрязнения (рис. 1).

Рисунок 1: Репрезентативные 3D-органоиды. Трехмерные органоиды (А) тощей кишки и (В) толстой кишки тщательно исследуются под микроскопом перед получением монослоев. Особое внимание уделяется оценке предыдущих моделей роста, структурной целостности, а также наличию каких-либо примесей или загрязнений. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

1. Удалите органоидную среду (табл. 1) из лунок с помощью органоидов 3D крипты. Добавьте 1 мл ледяного PBS на лунку и аккуратно растворите базальную мембрану пипетированием вверх и вниз с помощью наконечника p1000.
2. Соберите все растворенные органоиды в пробирку объемом 15 мл, предварительно заполненную 10 мл ледяного PBS. Центрифугируйте пробирку при давлении 250 x g, 10 мин при 4 °C. Аспирируйте надосадочную жидкость.
3. Ресуспендируйте гранулу в 1 мл теплого (37 °C) 0,05 % (v/v) трипсина/ЭДТА (на этом этапе можно объединить 2 пробирки). Выдерживать в течение 5 минут при температуре 37 °C на водяной бане, а затем положить прямо на лед, чтобы остановить реакцию.
4. Подвешиваем на льду 20 раз с наконечником p1000, и еще 15 раз с наконечником p1000 + наконечником p200 сверху. Добавьте 10 мл ледяного DMEM с добавлением 10% (v/v) фетальной сыворотки теленка (FCS).
5. Центрифужная пробирка при 1 000 x g, 10 мин при 4 °C. Надосадочную жидкость отбраковать и ресуспендировать гранулу в 1 мл однослойной среды (табл. 1).
6. Определите количество живых клеток на мл с помощью камеры Нейбауэра в соответствии с инструкциями производителя.
7. Извлеките раствор покрытия из апикального отсека и замените его 500 μL теплой (37 °C) однослойной среды. Добавьте в базолатеральный отсек 3 мл однослойной среды.
8. Определите сопротивление холостым элементам (TEER) каждой пустой транслунальной вставки, как подробно описано в шаге 3. Время, в течение которого в апикальной камере отсутствует среда, должно быть как можно короче, чтобы предотвратить высыхание клеток.
9. Удалите апикальную монослойную среду и добавьте для 2D-культуры тощей кишки 2 x 10⁵ эпителиальных клеток и для 2D-культуры толстой кишки 1,5 x^{10 5} эпителиальных клеток в 500 мкл монослойной среды в апикальную камеру каждого трансвелла.
10. Меняйте среду и измеряйте TEER каждые 2-3 дня. Измерьте TEER перед сменой среды. Осторожно отсадите среду апикального и базального отдела и замените ее 500 мкл или 3 мл свежей, теплой (37 °C) среды.
    1. Для органоидов тощей кишки: на 16-й день, после посева, перейти с однослойной среды на среду дифференцировки (табл. 1). Для органоидов толстой кишки: смените среду на 7-й день на среду для дифференцировки.
11. Меняйте дифференциационную среду каждый день и выполняйте измерение TEER при каждой смене среды. На 18-й день (для органоидов тощей кишки) или на 9-й день (для органоидов толстой кишки), после посева, приступают к функциональным экспериментам.

3. Измерение трансэпителиального электрического сопротивления (TEER)

ПРИМЕЧАНИЕ: Все измерения проводятся в безопасном шкафу во избежание загрязнения. Перед засевом ячеек каждый пустой колодец с покрытием измеряется для получения отдельных значений заготовки. Вольт-омметр хранит значения на введенном USB-устройстве.

1. Очистите электрод палочки для еды этанолом 70% (v/v) и дайте электроду полностью высохнуть. Тем временем достаньте тарелку из инкубатора и поставьте ее под шкаф.
2. Введите короткий рычаг электрода палочки для еды в апикальный отсек вкладышей, а длинный рычаг - в базолатеральный отсек вкладыша. Избегайте контакта короткой руки с клеточным слоем.
3. Измерьте трансэпителиальное электрическое сопротивление каждого трансвелла. Дайте вольт-омметру сбалансироваться, чтобы обеспечить стабильное измерение. Измерьте значения TEER, нажав кнопку «Сохранить».
4. Продолжайте шаги 3.2 и 3.3 с оставшимися лунками. Дойдя до последней скважины, вольт-омметр открывает запрос на сохранение данных на USB-устройстве. Нажмите кнопку Сохранить.
5. Очищайте электрод после каждой пластины и в конце измерения и дайте ему полностью высохнуть перед хранением.
6. Вычтите из измеренных ячеек пустые значения, определенные перед затравкой ячеек.

4. Исследования электрофизиологического транспорта с использованием техники камеры Уссинга

ПРИМЕЧАНИЕ: Определение электрофизиологических транспортных исследований выполняется с помощью камеры Уссинга, состоящей из двух камерных отсеков, разделенных эпителием. Эта камера соединена с напряжением с помощью электродов Ag/AgCl. Этот метод позволяет отслеживать активные электрогенные процессы переноса эпителия по изменению тока короткого замыкания (I_sc), индуцированного напряжением зажима, а также сопротивления тканей (R_t), рассчитанного по закону Ома. I_sc и R_t регистрируются каждые 6 с в течение всего эксперимента. В ходе эксперимента исследуемая ткань аэрируется карбогеном и инкубируется с модифицированными растворами Кребса-Хенселеита для обеспечения жизнеспособных условий. Индометацин (10 мкМ) добавляют в буферные растворы для ингибирования синтеза простагландинов²⁶.

1. Прогреть слизистые и серозные буферные растворы до 37 °С и аэрировать карбогеном. Соберите отдельные камеры, используя пустую вставку для каждой отдельной камеры. Убедитесь, что все апикальные стороны трансвеллов обращены в одном направлении.
2. Заполните все камеры 5 мл предварительно подогретого буферного раствора слизистой оболочки (табл. 2). Подключите все электроды от зажима напряжения к отдельным камерам в соответствии с инструкциями производителя. Убедитесь, что пузырьки газа не мешают электродам, чтобы обеспечить правильное измерение.
3. Откалибруйте программное обеспечение камеры Ussing в соответствии с этими условиями, нажав кнопку Rf/dpI в программном обеспечении voltage-clamp. Сопротивление всех используемых пустых вставок должно быть одинаковым (~ 70 Ом), а ток должен быть около 0 мВ (± 5 мВ). Если это не относится к некоторым камерам, проверьте правильное расположение электродов или пузырьков в системе.
4. Снимите все электроды и выбросьте использованный буферный раствор. Откройте все отдельные камеры и удалите пустые вставки. Следите за тем, чтобы порядок отдельных камер соблюдался.
5. Переместите пластину лунки со вставками из инкубатора в защитный шкаф. Осторожно отсасывайте базолатеральную и апикальную среду.
6. Промойте клетки, добавив 500 мкл теплого (37 °C) буфера слизистой оболочки в апикальную камеру и 3 мл серозального буфера в базолатеральную камеру. Отсадите буферы и повторите 2 раза.
7. Снимите вставки с пластины. Аккуратно снимите опоры вставок. Поместите вставки в камеры Ussing и убедитесь, что ориентация вставок такая же, как и на этапе калибровки. Соберите отдельные камеры, как показано на рисунке 2.
8. Заполните камеры, обращенные к базолатеральной стороне клеток, 5 мл серозального буфера (табл. 2), а камеру, обращенную к апикальной камере, - 5 мл буфера слизистой оболочки.
9. Подсоедините электроды и аэрационные трубки к каждой отдельной камере. Начните измерение в программном обеспечении Ussing. Дайте уравновеситься в течение 15 минут.
10. Измените условия с обрыва цепи на состояние короткого замыкания. Уравновесьте от 5 минут до 10 минут. Добавьте 10 мкМ форсколина в серозальную камеру.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Добавление форсколина может быть заменено другими агентами/веществами в зависимости от отдельных сегментов кишечника и исследовательских вопросов.
11. Через 15 минут либо добавьте больше агентов таким же образом, как и форсколин, либо прекратите измерение. Снимите аэрационные трубки и электроды с отдельных камер. Вылейте буферные растворы обеих камер в миску.
12. Разберите камеры и либо выбросьте вкладыши, либо используйте их для последующего анализа (например, иммуногистохимии или анализа экспрессии)

Рисунок 2: Схематическая структура камеры Уссинга. На дисплее представлены обе камеры, разделенные мембраной с выращенным 2D монослоем. Обе камеры проветриваются карбогеном; Напряжение и ток контролируются двумя электродами на камеру. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

5. Анализ данных, полученных при настройке камеры Уссинга

1. Импортируйте данные, сгенерированные программным обеспечением для измерения напряжения, в подходящий редактор электронных таблиц.
2. Чтобы определить базальные_{значения I, sc} и R, рассчитаем среднее значение 10 последовательных точек данных, полученных через 10 мин после инициализации условий короткого замыкания. Каждая отдельная камера служит технической репликацией, в то время как каждый проход органоидов служит биологической репликацией.
3. Чтобы оценить эффекты применяемых агентов, вычислите среднее значение 10 последовательных точек данных непосредственно перед добавлением агента. Сравните это среднее значение с максимальным (или минимальным) значением, наблюдаемым после применения агента. Полученные данные представлены в виде среднего ± стандартного отклонения (SD).

Результаты

Этот протокол способствует надежному получению 2D-монослоев свиней путем дезагрегирования 3D-органоидов, полученных из тощей и толстой кишки свиней. В течение периода культивирования, составляющего 16 дней для органоидов тощей кишки и 9 дней для органоидов толстой кишк...

Обсуждение

Этот протокол описывает метод преобразования укоренившихся 3D-органоидов свиньи в одиночные клетки, которые затем засеваются на трансвелловые мембраны для формирования неповрежденного монослоя. Такая конфигурация обеспечивает доступ к апикальной стороне клеток, о?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
24 well plate	SARSTEDT AG & Co. KG	8,33,922
A83-01	MedChemExpress, New Jersey, USA	HY-10432	Store at -20 °C. Thaw when needed
accujet S	Brand GmbH + Co KG, Wertheim, Germany	26351
Advanced DMEM/F12 Medium	Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA	12634010	Store at 4 °C
B27 supplement	Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA	17504044	Store at -20 °C. Thaw when needed
CaCl2.2 H2O	Merck KGaA, Darmstadt, Germany	C3306	Store at room temperature
D(+)-Glucose (wasserfrei)	Merck KGaA, Darmstadt, Germany	1.08337	Store at room temperature
DAPT	MedChemExpress, New Jersey, USA	HY-13027	Store at -20 °C. Thaw when needed
D-Mannitol	Merck KGaA, Darmstadt, Germany	M4125	Store at room temperature
DMSO	Sigma-Aldrich, Schnelldorf, Germany	154938	Store at room temperature
Electrode-Set (AgCl/PtIr/Std.)	Scientific Instruments, Simmerath, Germany	#1316
Eppendorf Research plus	Eppendorf SE, Hamburg, Gemany	3123000063
Eppendorf Research plus	Eppendorf SE, Hamburg, Gemany	3123000047
EVOM3 Manual Epithelial Volt Ohm Meter	World precision instruments, Sarasota, USA	EVM-MT-03-01
FBS	Sigma-Aldrich, Schnelldorf, Germany	F7524	Store at -20 °C. Thaw when needed
Forskolin	Sigma-Aldrich, Schnelldorf, Germany	F6886	Store at -20 °C. Thaw when needed
gasprofi 1 SCS micro	WLD-TEC GmbH, Arsenhausen, Germany	60,04,000
Gastrin 1	MedChemExpress, New Jersey, USA	HY-P1097	Store at -20 °C. Thaw when needed
Glutamax	Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA	35050061	Store at 4 °C.
HCl	Sigma-Aldrich, Schnelldorf, Germany	1090571000	Store at room temperature
HEPES	Sigma-Aldrich, Schnelldorf, Germany	H0887	Store at 4 °C
Herasafe 2025 Class II Biological Safety Cabinet	Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA	51033316
Incubator ICO105	Memmert GmbH + Co.KG, Schwabach, Germany	62,20,143
Indomethacin	Merck KGaA, Darmstadt, Germany	I7378	Store at room temperature
KCl	Merck KGaA, Darmstadt, Germany	1.04936	Store at room temperature
L-Glutamin	Sigma-Aldrich, Schnelldorf, Germany	G7513	Store at -20 °C. Thaw when needed
LWRN Supernatant	selfmade		Store at -20 °C. Thaw when needed. LWRN supplement is produced according to Miyoshi et al. (2012)
Matrigel Basement Membrane Matrix, LDEV-free, 10 mL	Corning Incorporated - Life Sciences	354234	Store at -20 °C. Thaw carefully on ice when needed
Megafuge 1.OR	Heraeus Instruments, Osterode, Germany	75003060
MgCl2.6 H2O	Merck KGaA, Darmstadt, Germany	1.05833	Store at room temperature
Na2HPO4.2H2O	Merck KGaA, Darmstadt, Germany	1.06580	Store at room temperature
N-Acetyl-L-cysteine	Sigma-Aldrich, Schnelldorf, Germany	A7250	Store at -20 °C. Thaw when needed
NaCl	Merck KGaA, Darmstadt, Germany	1.06404	Store at room temperature
NaH2PO4.H2O	Merck KGaA, Darmstadt, Germany	1.06346	Store at room temperature
NaHCO3	Merck KGaA, Darmstadt, Germany	1.06329	Store at room temperature
Neubauer improved chamber	Glaswarenfabrik Karl Hecht, Sondheim vor der Rhön, Germany	40442712
Olympus IX70 iverted Microscope	Olympus Corporation, Hamburg, Germany
Pen/Strep	Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA	15140122	Store at -20 °C. Thaw when needed
PolymyxinB	Sigma-Aldrich, Schnelldorf, Germany	P4932-1MU	Store at -20 °C. Thaw when needed
Primovert microscope stand with binocular phototube	Zeiss	415510-1101-000
rm EGF	Prepotech, New Jersey, USA	315-09	Store at -20 °C. Thaw when needed
SB202190	MedChemExpress, New Jersey, USA	HY-10295	Store at -20 °C. Thaw when needed
Snapwell 3801	Corning Incorporated - Life Sciences	3801
Trypsin/EDTA	Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA	25300054
Ussing Base System	Scientific Instruments, Simmerath, Germany	#1317
Ussing Diffusion Chamber	Scientific Instruments, Simmerath, Germany	SKU 1307
Voltage/Current Clamp VCC6	Scientific Instruments, Simmerath, Germany	SKU 1310
Y27632	MedChemExpress, New Jersey, USA	HY-10583	Store at -20 °C. Thaw when needed