Nous remercions James Waters, Gable Wadsworth et Bo Broadwater pour la lecture critique du manuscrit. Nous remercions également quatre évaluateurs anonymes pour leurs commentaires utiles. Nous reconnaissons l&#39;appui financier du Georgia Institute of Technology, le prix du Burroughs Wellcome Fund carrière à l&#39;interface scientifique, et la subvention du réseau de recherche de l&#39;étudiant de la NSF Physique des systèmes vivants.

1. Préparation ADN double brin de l&#39;échantillon <ol><li> Concevoir ADN courbes globalement en répétant une séquence de 10-mer. Par exemple 5&#39;-GTGCCAGCAACAGATAGC, - (TTTATCATCCTTTATCATCC X) 7 - TTTCATTCGAGCTCGTTGTTG-3 &#39;de l&#39;ADN est une courbe de 186 bp, où X est une base aléatoire supplémentaire et la séquence flanquant la séquence 10-mère sont des séquences de répétition adaptateur. REMARQUE:. Dans cet exemple, deux 10-mères ayant des préférences opposées à la formation nucléosome basé sur une grande échelle étude d&#39;occupation nucléosome par Kaplan et al 15 ont été choisis. Depuis la répétition hélicoïdale de l&#39;ADN bicaténaire est proche de 10 pb, toute déviation nette de l&#39;axe hélicoïdal de la 10-mer s&#39;accumule pour produire une forme d&#39;arc de cercle (figure 3A). Etant donné que la période hélicoïdale est plus proche de 10,5 pb, une base supplémentaire est inséré après tous les deux répétitions de conserver la structure recourbée comme plane que possible. Ces séquences plus courtes de 200 pb peuvent être commandés auprès de companies qui offre gène service de synthèse. Il est commode pour flanquer ces séquences avec des séquences d&#39;adaptation communes pour les étapes ultérieures. Le mode opératoire est schématisé sur la figure 3B. </li><li> Effectuer PCR avec l&#39;amorce 1 (GTGCCAGCAACAGATAGC) et l&#39;amorce 2 (/ 5Cy3/TAAATTCCTACAACAACGAGCTCGAATG). NOTE: Primer 2 est marqué avec le Cy3 donneur FRET à l&#39;extrémité 5 &#39;. Une recette typique de la PCR et le protocole de cyclage sont présentés dans les tableaux 1 et 2. </li><li> Faire la PCR Primer 3 (/ 5BioTEG/GAAACATAG/iCy5/GAATTTACCGTGCCAGCAACAGATAGC) et l&#39;amorce 4 (CAACAACGAGCTCGAATG). NOTE: Primer 3 est marqué avec l&#39;accepteur Cy5 FRET à travers la colonne vertébrale et la biotine-segment de liaison à l&#39;extrémité 5 &#39;. Recette PCR et le protocole de cyclisme sont comme ci-dessus. </li><li> Purifier les produits de la PCR en utilisant un kit de nettoyage de PCR. </li><li> Mélanger le produit marqué au Cy3 et Cy5 le produit marqué dans un tampon pour l&#39;échange de brin (100 mM de NaCl, 10 mM Tris-HCl pH 7,0, 1 mM EDTA) à des concentrations finales de 0,4 et# 181; M et 0,1 uM, respectivement. NOTE: Le Cy3-ADN en excès augmente la concentration du duplex portant à la fois Cy3 et Cy5 en tant que résultat de l&#39;échange de brin. </li><li> brins de change par incubation à 98,5 ° C pendant 2 min, refroidissement progressif à 5 ° C avec un taux de 0,1 ° C / s de la rampe, et en incubant à 5 &#160; ° C pendant 2 heures. </li></ol> 2. Gel d&#39;électrophorèse pour détecter ADN double brin courbure <ol><li> Verser le gel de polyacrylamide en mélangeant 16,17 acrylamide et de solutions de bis-acrylamide à un rapport 29.2:0.8, 5% (p / v) dans 1 x Tris / Borate / EDTA (TBE) tampon à pH 8,0. Note: 10 ml de solution de gel contient: 1.217 ml 40% d&#39;acrylamide, 0,667 ml 2% de bis-acrylamide, 1 ml TBE 10X, 100 L persulfate d&#39;ammonium (APS) 10%, 10 L TEMED, et le reste est dH 2 O. Solidification complète du gel prend environ 30 min. </li><li> Charger le gel de polyacrylamide avec des échantillons d&#39;ADN et de l&#39;échelle d&#39;ADN dans un tampon de charge 1X (5% de glycerol, 0,03% (p / v) de bromophénol blue) et exécuter le gel à 5-8 V / cm à 4 ° C pendant 45 min ou jusqu&#39;à ce que le front de colorant se rapproche de l&#39;extrémité du gel. </li><li> Colorer le gel en utilisant un tampon TBE 1X contenant 0,5 g / ml de bromure d&#39;éthidium pendant 30 min. Identifier les bandes d&#39;ADN sous illumination UV. Comparer les positions des bandes avec le marqueur de taille (100 bp DNA ladder) pour calculer les tailles apparentes des molécules d&#39;ADN. NOTE: Curved ADN se déplacent généralement plus lent que les ADN droites. </li></ol> 3. Préparation de débit cellulaire <ol><li> Percer 6-7 paires de trous le long de deux bords opposés d&#39;une lame de verre (3&#39;&#39; x 1&#39;&#39;) à l&#39;aide d&#39;une perceuse à colonne et des trépans de forage diamantés. Après le perçage, frotter la lame dans l&#39;eau qui coule pour enlever la poudre de verre visible. REMARQUE: Les trous servent entrées et sorties perfusion. Pendant le forage, la lame de refroidissement à l&#39;eau est importante pour empêcher la fissuration. </li><li> Placer les lames en position verticale dans un bocal de verre et de le remplir avec de l&#39;eau. Soniquer pendant 15 minutes et de les transférer dans un autre pot de verre dedicated pour le nettoyage à l&#39;acétone. Remplissez-le avec de l&#39;acétone et de traitement par ultrasons pendant 15 min. Rincer les lames avec de l&#39;éthanol à l&#39;aide d&#39;un flacon pulvérisateur, puis avec de l&#39;eau. Placez-les dans un bocal en polypropylène, le remplir avec 5 M d&#39;hydroxyde de potassium, et de traitement par ultrasons pendant 15 min. Enfin, soniquer les diapositives dans l&#39;eau pendant 15 min. Nettoyer les lamelles (n ° 1, 24 x 40 mm) en utilisant le même protocole. NOTE: diapositives et des lamelles nettoyés peuvent être stockés dans dH 2 O pour une utilisation à long terme. </li><li> Mélanger 1 mg de biotine-PEG-silane (MW 3400) avec 80 mg de la norme MPEG-silane (MW 2000) dans 340 L de 0,1 solution de bicarbonate de sodium M. Bien mélanger et centrifuger le mélange brièvement pour se débarrasser de bulles. REMARQUE: La fonctionnalisation de la surface avec du polyéthylène glycol (PEG) permet de réduire la liaison non spécifique de l&#39;ADN à la surface. </li><li> Mettre 80 L de la solution de PEG à chaque lame et une lamelle couvre-objet abaisser doucement dessus. Attendez 45 min. Séparer la lamelle de la diapositive avec des pincettes, les rincer abondamment avec de l&#39;dH 2 O et laisser tourlet sèche à l&#39;air libre. </li><li> Placez minces bandes de ruban adhésif double face sur la diapositive à former des canaux. Aligner une lamelle dessus et appuyez fermement sur la lamelle contre la glissière pour former des canaux étanches aux liquides. Utilisez cinq minutes époxy pour sceller les bords des canaux. </li></ol> 4. Préparation de Trolox Solution <ol><li> Mettez ~ 30 mg Trolox et 10 ml dH 2 O dans un ballon et utiliser une barre aimant d&#39;agitation pour agiter la solution à l&#39;air libre pendant 18 heures. </li><li> Filtrer la solution à l&#39;aide d&#39;un filtre de 0,2 um et ajuster le pH à 7 par addition de ~ 6 pi de 1 M de base Tris (pH 11). Remarque: le Trolox est un réactif anti-clignotement qui est couramment utilisé dans une seule molécule études 18. L&#39;action de antidécoloration de Trolox vient de son dérivé oxydé qui est présent dans la solution Trolox partiellement dégradé 19. À dissolution rapide Trolox dans le méthanol ou solution Tris pH élevé doit être évitée en raison de l&#39;oxydation inefficace. </li></ol> 5. Single-molImagerie ecule <ol><li> Injecter 15 ul de solution de neutravidine (0,5 mg / ml) dans le canal et attendre pendant 2 minutes avant de rincer avec 100 ul de tampon T50 (10 mM Tris-HCl, 50 mM de NaCl, pH 7,0). </li><li> Injecter 50 ul d&#39;échantillon d&#39;ADN (50 à 100 pM) dans le canal. Attendez 5 minutes et rincer l&#39;ADN non lié à une distance de 100 L de tampon T50. NOTE: les molécules d&#39;ADN vont se lier spécifiquement à la surface à travers l&#39;interaction neutravidine-biotine. </li><li> Remplir les puits avec le tampon de formation d&#39;image qui contient un système de piégeage de l&#39;oxygène 20 (100 mM PCD, PCA 5 mM, 1 mM de Trolox, et NaCl 500 mM). </li><li> Réglez le EMCCD en mode de transfert de trame pour écouter 2 x 2 images regroupées par casiers (256 x 256) à l&#39;ordinateur à 25 images par seconde. </li><li> Mettre de l&#39;huile d&#39;immersion sur l&#39;objectif du microscope, et fixer la cellule d&#39;écoulement sur la platine du microscope en utilisant des clips spécimens. Gros la mise au point en regardant le motif de réflexion de laser sur le mur. Ajustez la mise au point avec l&#39;affichage en direct de la fluorescence imans sur le moniteur. </li><li> Commencer l&#39;acquisition de données avec le laser 532 nm sur. Vérifiez l&#39;affichage en direct et la mise au point si nécessaire. Arrêter l&#39;acquisition des données lorsque la plupart des molécules ont Photo-blanchissement. NOTE: Dans cette installation, un programme de laboratoire écrit C pour contrôler le microscope et afficher des images en direct sur l&#39;écran quand ils sont enregistrés sur le disque dur est utilisé. </li></ol> 6. Traitement de l&#39;image et l&#39;analyse des données REMARQUE: Une série de temps de 256 x 256 images sont traitées par un code MATLAB pour générer une seule molécule traces de temps de Cy3 et Cy5 intensités. Pour jumeler pixels entre le canal et le canal donneur accepteur de l&#39;image split-vue, 6-7 paires de Cy3 et Cy5 taches, chaque paire de la même molécule uniformément dispersés dans le champ de vision, sont récoltés manuellement, et une transformation affine est calculée en utilisant les coordonnées de ces points en tant que points d&#39;ancrage. <ol><li> Utilisation d&#39;un script MATLAB, regarder à travers tous les temps seule molécule traces tchapeau montrent de multiples transitions entre les signaux faibles et élevées de FRET. Identifier les États boucle et non bouclé. REMARQUE: Le signal de FRET est définie comme l&#39;intensité Cy5 (I a) divisé par la somme des intensités Cy3 et Cy5 (I a + I d). État boucle a une valeur élevée de FRET en état non bouclé a une valeur faible de FRET. L&#39;histogramme de signaux FRET partir d&#39;une seule molécule est bimodale distribué en raison du bouclage et débouclage réversible. </li><li> Trouver le seuil qui sépare les deux distributions en déterminant l&#39;intersection entre les deux courbes de Gauss de rangement. </li><li> Calculer l&#39;efficacité de FRET comme <img fo:content-width="0.6in" src="/files/ftp_upload/51667/eq7.jpg" /> et assigner les États en boucle avec des valeurs élevées de FRET et les Etats non tricotées avec de faibles valeurs de FRET. </li><li> Utilisation d&#39;un script MATLAB, analyser le nombre cumulatif de molécules (N (t)) qui en boucle (ouatteint l&#39;état haut FRET) à différents laps de temps depuis le début de l&#39;acquisition de données. NOTE: Depuis une molécule ADN double brin peut commencer à n&#39;importe quel conformation de l&#39;état non bouclé au début de l&#39;acquisition de données, le taux d&#39;accroissement de la population en boucle reflète le taux moyen boucle moyenne sur conformations initiales. Extraire la boucle de vitesse k boucle en ajustant N (t) avec une fonction exponentielle: <img fo:content-width="1.8in" src="/files/ftp_upload/51667/eq1.jpg" /> Si l&#39;augmentation biphasique, il peut être muni d&#39;une double fonction exponentielle: <img fo:content-width="2.2in" src="/files/ftp_upload/51667/eq2.jpg" /> Dans ce cas, k boucle est obtenu à partir: <img fo:content-width="1.7in" src="/files/ftp_upload/51667/eq3.jpg" /> NOTE: En théorie, la probabilité de survie que d&#39;un polymère n&#39;a pas bouclé au temps t n&#39;est pas une fonction exponentielle simple ou double 12. FITT exponentielleING est utilisé comme un moyen pratique d&#39;extraire le temps de doublement moyen. </li></ol> 7. Détermination du facteur J NOTE: Le facteur J représente la façon concentrée une extrémité d&#39;un ADN double brin est de l&#39;ordre de l&#39;autre extrémité. Elle peut être déterminée par interpolation de la concentration d&#39;un segment d&#39;extrémité de l&#39;ADN qui produirait la même vitesse de réaction avec l&#39;autre segment d&#39;extrémité comme mesuré le taux de bouclage. Expérimentalement, un segment d&#39;extrémité est immobilisée sur la surface, et l&#39;autre segment d&#39;extrémité est introduit à une certaine concentration c. Si le taux de recuit mesurée entre les deux extrémités est recuit k, alors le facteur de J 21 est donnée par <img fo:content-width="0.6in" src="/files/ftp_upload/51667/eq4.jpg" /> . La constante de vitesse de recuit (recuit k = k recuit / C) est indépendant de la concentration de la sonde. <ol><li> Débit 20 pi de 30-50 pM biotine-Cy5 oligo (Primer 3) into un canal neutravidine revêtu. Rincer le canal avec 100 pi de T50 à laver oligos non liés. </li><li> Préparer le tampon de formation d&#39;image tel que décrit dans la partie 5 avec l&#39;addition d&#39;oligo Cy3 (amorce 2) à une concentration finale de 50 nM. Couler ce tampon d&#39;imagerie dans le canal. </li><li> Tout en gardant le laser 532 nm, tournez brièvement le laser 640 nm à identifier les emplacements des oligos Cy5 liés à la surface. Éteignez le laser 640 nm et commencer à surveiller le signal de FRET. REMARQUE: Lors de l&#39;hybridation d&#39;un oligo Cy3 à un Cy5 oligo lié à la surface, Cy5 fluorescence se posera de FRET. </li><li> Utilisation d&#39;un script MATLAB, analyser le nombre de molécules qui commencent dans l&#39;état non lié (faible intensité de Cy5), mais se transforment plus tard en l&#39;état (haute intensité de Cy5) recuit en fonction du temps à partir des traces d&#39;intensité Cy5. </li><li> Tracer ce nombre de molécules en fonction du temps recuits. Monter cette courbe avec une fonction exponentielle simple ( <img fo:content-width="1.8in" src="/files/ftp_upload/51667/eq5.jpg"/&gt;) Pour obtenir le taux de recuit (k recuit). </li><li> Répéter cette expérimentation à différentes concentrations Cy3 oligo (60, 100, et 180 nM) pour confirmer la linéarité entre le taux d&#39;hybridation et la concentration des réactifs. Extraire la constante de vitesse de recuit de second ordre (k recuit ) À partir de la pente. </li><li> Calculer le facteur de J de <img fo:content-width="0.6in" src="/files/ftp_upload/51667/eq6.jpg" /> , Où k est le taux boucle en boucle mesurée dans les mêmes conditions de tampon. </li></ol>

<ol>
	<li>Garcia, H. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+consequences+of+tightly+bent+DNA:+The+other+life+of+a+macromolecular+celebrity.">Biological consequences of tightly bent DNA: The other life of a macromolecular celebrity.</a> Biopolymers. 85, 115-130 (2007).</li><li>Wiggins, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+flexibility+of+DNA+on+short+length+scales+probed+by+atomic+force+microscopy.">High flexibility of DNA on short length scales probed by atomic force microscopy.</a> Nature Nanotechnology. 1, (2006).</li><li>Lionberger, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cooperative+kinking+at+distant+sites+in+mechanically+stressed+DNA.">Cooperative kinking at distant sites in mechanically stressed DNA.</a> Nucleic Acids Research. 41, 6785-6792 (2011).</li><li>Shore, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+flexibility+studied+by+covalent+closure+of+short+fragments+into+circles.">DNA flexibility studied by covalent closure of short fragments into circles.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 78, 4833-4837 (1981).</li><li>Geggier, S., Vologodskii, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence+dependence+of+DNA+bending+rigidity.">Sequence dependence of DNA bending rigidity.</a> Proc Nat Acad Sci U S A. 107, 15421-15426 (1992).</li><li>Smith, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+mechanical+measurements+of+the+elasticity+of+single+DNA+molecules+by+using+magnetic+beads.">Direct mechanical measurements of the elasticity of single DNA molecules by using magnetic beads.</a> Science. 258, 1122-1126 (1992).</li><li>Peters, J. P., Maher, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+curvature+and+flexibility+in+vitro+and+in+vivo.">DNA curvature and flexibility in vitro and in vivo.</a> Quarterly Reviews of Biophysics. 43, 23-63 (2010).</li><li>Cloutier, T. E., Widom, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+sharp+bending+of+double-stranded+DNA.">Spontaneous sharp bending of double-stranded DNA.</a> Molecular Cell. 14, 355-362 (2004).</li><li>Du, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclization+of+short+DNA+fragments+and+bending+fluctuations+of+the+double+helix.">Cyclization of short DNA fragments and bending fluctuations of the double helix.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 5397-5402 (2005).</li><li>Yuan, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T4+DNA+ligase+is+more+than+an+effective+trap+of+cyclized+dsDNA.">T4 DNA ligase is more than an effective trap of cyclized dsDNA.</a> Nucl. Acids Res. 35, 5294-5302 (2007).</li><li>Manzo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+nonspecific+binding+of+lambda+repressor+on+DNA+looping+dynamics.">The effect of nonspecific binding of lambda repressor on DNA looping dynamics.</a> Biophysical Journal. 103, 1753-1761 (2012).</li><li>Le, T. T., Kim, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+shape-dependent+looping+probability+of+DNA.">Measuring shape-dependent looping probability of DNA.</a> Biophys. J. 104, 2068-2076 (2013).</li><li>Vafabakhsh, R., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extreme+bendability+of+DNA+less+than+100+base+pairs+long+revealed+by+single-molecule+cyclization.">Extreme bendability of DNA less than 100 base pairs long revealed by single-molecule cyclization.</a> Science. 337, 1097-1101 (2012).</li><li>Friedman, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viewing+dynamic+assembly+of+molecular+complexes+by+multi-wavelength+single-molecule+fluorescence.">Viewing dynamic assembly of molecular complexes by multi-wavelength single-molecule fluorescence.</a> Biophysical Journal. 91, 1023-1031 (2006).</li><li>Kaplan, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+DNA-encoded+nucleosome+organization+of+a+eukaryotic+genome.">The DNA-encoded nucleosome organization of a eukaryotic genome.</a> Nature. 458, 362-366 (2009).</li><li>Koo, H. S., Crothers, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calibration+of+DNA+curvature+and+a+unified+description+of+sequence-directed+bending.">Calibration of DNA curvature and a unified description of sequence-directed bending.</a> Proc Nat Acad Sci U S A. 85, 1763-1767 (1988).</li><li>Prosseda, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+temperature-induced+narrow+DNA+curvature+range+sustains+the+maximum+activity+of+a+bacterial+promoter+in+vitro.">A temperature-induced narrow DNA curvature range sustains the maximum activity of a bacterial promoter in vitro.</a> Biochemistry. 49, 2778-2785 (2010).</li><li>Rasnik, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonblinking+and+long-lasting+single-molecule+fluorescence+imaging.">Nonblinking and long-lasting single-molecule fluorescence imaging.</a> Nature Methods. 3, 891-893 (2006).</li><li>Cordes, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+mechanism+of+Trolox+as+antiblinking+and+antibleaching+reagent.">On the mechanism of Trolox as antiblinking and antibleaching reagent.</a> J. Am. Chem. Soc. 131, 5018-5019 (2009).</li><li>Aitken, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+oxygen+scavenging+system+for+improvement+of+dye+stability+in+single-molecule+fluorescence+experiments.">An oxygen scavenging system for improvement of dye stability in single-molecule fluorescence experiments.</a> Biophys J. 94, 1826-1835 (2008).</li><li>Taylor, W. H., Hagerman, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+the+method+of+phage+T4+DNA+ligase-catalyzed+ring-closure+to+the+study+of+DNA+structure:+II.+NaCl-dependence+of+DNA+flexibility+and+helical+repeat.">Application of the method of phage T4 DNA ligase-catalyzed ring-closure to the study of DNA structure: II. NaCl-dependence of DNA flexibility and helical repeat.</a> Journal of Molecular Biology. 212, 363-376 (1990).</li><li>Bolshoy, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Curved+DNA+without+A-A:+experimental+estimation+of+all+16+DNA+wedge+angles.">Curved DNA without A-A: experimental estimation of all 16 DNA wedge angles.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 88, 2312-2316 (1991).</li><li>Gibson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+DNA+fragments+in+yeast+by+one-step+assembly+of+overlapping+oligonucleotides.">Synthesis of DNA fragments in yeast by one-step assembly of overlapping oligonucleotides.</a> Nucl. Acids Res. 37, 6984-6990 (2009).</li><li>Vologodskii, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bending+of+short+DNA+helices.">Bending of short DNA helices.</a> Artif DNA PNA XNA. 4, (2013).</li><li>Hoover, D. M., Lubkowski, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNAWorks:+an+automated+method+for+designing+oligonucleotides+for+PCR-based+gene+synthesis.">DNAWorks: an automated method for designing oligonucleotides for PCR-based gene synthesis.</a> Nucl. Acids Res. 30, (2002).</li><li>Waters, J. T., Kim, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Equilibrium+Statistics+of+a+Surface-Pinned+Semiflexible+Polymer.">Equilibrium Statistics of a Surface-Pinned Semiflexible Polymer.</a> Macromolecules. 46, 6659-6666 (2013).</li><li>Mills, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophoretic+evidence+that+single-stranded+regions+of+1+or+more+nucleotides+dramatically+increase+the+flexibility+of+DNA.">Electrophoretic evidence that single-stranded regions of 1 or more nucleotides dramatically increase the flexibility of DNA.</a> Biochemistry. 33, 1797-1803 (1994).</li></ol>

Les auteurs déclarent aucun conflit d&#39;intérêt.

Un test simple molécule unique basé sur le FRET a été utilisé pour étudier la cinétique de bouclage des ADN de différentes formes intrinsèques. ADN courbes peuvent être préparés par la répétition d&#39;une séquence 10-mère en phase avec la période d&#39;hélice de 10,5 pb, et leurs courbures peuvent être estimées en utilisant PAGE. Ces dsDNAs sont conçus avec des extrémités cohésives pour permettre la stabilisation de la boucle transitoire. Nous avons extrait le taux de bouclage de l&#39;augmentat...

Comprendre les propriétés mécaniques des ADN double brin est d&#39;une importance fondamentale dans les sciences fondamentales et les applications d&#39;ingénierie. La structure de l&#39;ADN bicaténaire est plus compliqué que d&#39;une échelle hélicoïdale droite parce angles roulis, d&#39;inclinaison et de torsion entre les paires de base successives peuvent varier en fonction de la séquence. Fluctuations thermiques peuvent provoquer des ADN double brin à subir divers modes de fluctuations conformationnelles telles que la flexion, de torsion et d&#39;étirement. Transitions comme la fonte et de déformation peuvent également se produire dans des conditions extrêmes. Parmi ces propositions, ADNds flexion a l&#39;impact le plus notable biologique 1. ADNdb flexion est associée à la répression ou l&#39;activation de gènes en amenant deux sites distants proches les uns des autres. Il joue également un rôle important dans l&#39;emballage de l&#39;ADN à l&#39;intérieur du noyau de la cellule ou une capside virale. Déformation en flexion de l&#39;ADN bicaténaire peut être visualisée expérimentalement par microscopie à haute résolution (AFM 2 et 3 TEM), et la ThermodynAmics et cinétique peuvent être étudiés par des analyses en boucle, qui relient des sites chimiquement juxtaposés de l&#39;ADN double brin. Un tel dosage est une ligase dépendante cyclisation 4. Dans ce dosage, les molécules ADN double brin avec des extrémités collantes &quot;cohésives&quot; () sont circularisées ou dimérisés par l&#39;ADN ligase. En comparant les taux de cercle et la formation de dimère, on peut obtenir une concentration molaire efficace d&#39;une extrémité de l&#39;ADN dans le voisinage de l&#39;autre extrémité, qui est connu comme le facteur de J. Ce facteur de J est dimensionnellement équivalente à la densité de probabilité de trouver une extrémité de l&#39;ADN à une courte distance de l&#39;autre extrémité, et reflète ainsi la flexibilité de l&#39;ADN. Mesurer le facteur de J en fonction de la longueur de l&#39;ADN révèle de nombreuses caractéristiques de la mécanique d&#39;ADN dont la longueur de persistance 4,5. La chaîne de ver (WLC) modèle a été largement considéré comme le modèle de polymère canonique pour la mécanique ADN double brin sur la base de son succès dans explicationining les courbes force-extension obtenus dans l&#39;ADN tirant expériences 6 et prédire correctement les facteurs de J dsDNAs plus de 200 pb 7. Cependant, en utilisant l&#39;essai de cyclisation de molécules d&#39;ADNdb aussi courtes que 100 bp, et Cloutier Widom mesuré les facteurs J pour être de plusieurs ordres de grandeur plus élevés que la prédiction du modèle WLC 8. Un an plus tard, Du et al. produite facteurs J en accord avec le modèle WLC en utilisant le test de cyclisation avec des concentrations plus faibles de ligase et attribué le résultat anormal dans le groupe Widom à des concentrations élevées ligase utilisé 9. Cette controverse illustre l&#39;influence inévitable de l&#39;ADN ligase sur la cinétique de cyclisation en utilisant le test classique 9. En outre, l&#39;ADN ligase peut également affecter la structure de l&#39;ADN et de la rigidité à travers non spécifique 10,11 liaison. Pour éliminer les problèmes techniques de tests de bouclage protéine dépendante, nous avons récemment démontré une prottest de bouclage ein, à base de Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) 12. Dans ce procédé, des conformations en boucle sont détectées par FRET entre le donneur et l&#39;accepteur attaché à proximité des extrémités cohésives d&#39;une molécule d&#39;ADN. Un total de microscope de fluorescence par réflexion interne du type à objectif (TIRFM) est utilisé pour enregistrer des trajectoires en boucle réversible et débouclage événements à partir de molécules d&#39;ADN simple surface immobilisé pendant une période de temps prolongée. Cette méthode comporte l&#39;assemblage de molécules d&#39;ADN à base de PCR pour générer des molécules d&#39;ADN libre mésappariement, ce qui est une amélioration cruciale sur une méthode similaire par Vafabakhsh Ha et 13. L&#39;aspect unique molécule de ce protocole permet la mesure des distributions en plus de Ensemble moyennes tandis que l&#39;aspect FRET permet de mesurer la dynamique de l&#39;ADN de boucle à plusieurs reprises de la même molécule, même dans des conditions qui peuvent nuire à l&#39;activité de ligase. La configuration de TIRFM est illustré à la figure 1. Une coutumeStade-éprouvette conçu est placé sur un corps de microscope Olympus IX61. 532 nm et 640 nm lasers sont introduits à partir du côté et sont réfléchies par les miroirs elliptiques minuscules 14 dans l&#39;objectif d&#39;atteindre une grande NA angle d&#39;incidence critique à l&#39;interface lamelle couvre-objet dans l&#39;eau. Nous notons que plus répandue TIR par-objectif en utilisant des miroirs dichroïques ou configurations de TIR sur la base de prisme peut également être utilisé pour cette application de FRET. L&#39;image de fluorescence formée par le microscope est divisée en images de donneur et d&#39;accepteur par un miroir dichroïque. Ils sont ensuite convertis à la sur les deux moitiés d&#39;un EMCCD. Filtres d&#39;émission passe-longue supplémentaires sont utilisés pour réduire le signal de fond. Contrôle de la température est essentielle pour acquérir des données cinétiques reproductibles. Pour le contrôle de la température, l&#39;objectif est séparée de la pièce de nez du corps de microscope pour minimiser le transfert de chaleur, et de l&#39;eau à partir d&#39;une température contrôlée refroidisseur / réchauffeur est mis en circulation par l&#39;intermédiaire d&#39;un collier en laiton qui s&#39;adapte étroitement deautour du métal intérieur sous la veste objectif. Cette configuration est en mesure de réaliser robuste contrôle de la température à la surface de la lamelle couvre entre 15 et 50 ° C (Figure 2). Dans ce travail, la température de l&#39;échantillon a été maintenue à 24 ° C. Le protocole ci-dessous présente la procédure étape par étape pour la construction d&#39;ADN, de l&#39;estimation de la forme de l&#39;ADN, molécule expérience unique, et la détermination du facteur J.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="793">
	<tbody>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:351px;">Small DNA FRAG Extract Kit-100PR</td>
			<td style="width:124px;">VWR</td>
			<td style="width:135px;">97060-558</td>
			<td style="width:183px;"></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:351px;">Acrylamide 40% solution 500 mL</td>
			<td style="width:124px;">VWR</td>
			<td style="width:135px;">97064-522</td>
			<td style="width:183px;"></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Bis-acrylamide 2% (w/v) solution 500 mL</td>
			<td style="width:124px;">VWR</td>
			<td style="width:135px;">97063-948</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:351px;">GeneRuler 100 bp DNA Ladder, 100-1000 bp</td>
			<td style="width:124px;">Fermentas</td>
			<td>SM0241</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:351px;">Mini Vertical PAGE System</td>
			<td style="width:124px;">VWR</td>
			<td style="width:135px;">89032-300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:351px;">Syringe filter 0.2um CS50</td>
			<td style="width:124px;">VWR</td>
			<td style="width:135px;">A2666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:351px;">Trolox</td>
			<td style="width:124px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:135px;">238813-1G</td>
			<td>triplet state quencher</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:351px;">Protocatechuic acid (PCA)</td>
			<td style="width:124px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:135px;">08992-50MG</td>
			<td>oxygen scavenging system</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:351px;">Protocatechuate 3,4-Dioxygenase (PCD)</td>
			<td style="width:124px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:135px;">P8279-25UN</td>
			<td>oxygen scavenging system</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:351px;">mPEG-silane, MW 2000 1g</td>
			<td style="width:124px;">Laysan Bio</td>
			<td style="width:135px;">MPEG-SIL-2000-1g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:351px;">Biotin-PEG-Silane, MW 3400</td>
			<td style="width:124px;">Laysan Bio</td>
			<td style="width:135px;">Biotin-PEG-SIL-3400-1g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:351px;">Avidin, NeutrAvidin Biotin-binding Protein</td>
			<td style="width:124px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:135px;">A2666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:351px;">Phusion Hot Start High-Fidelity DNA Polymerase</td>
			<td style="width:124px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:135px;">F-540L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Gel/PCR DNA Fragments Extraction Kit</td>
			<td>IBI Scientific</td>
			<td>IB47020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:351px;">Premium plain glass microscope slides</td>
			<td style="width:124px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:135px;">12-544-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:351px;">VWR micro cover glass, rectangular, no. 1</td>
			<td style="width:124px;">VWR</td>
			<td style="width:135px;">48404-456</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:351px;">Fisher Scientific Isotemp 1006s Recirculating Chiller/Heater</td>
			<td style="width:124px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td>temperature control</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:351px;">Objective Cooling Collar</td>
			<td style="width:124px;">Bioptechs</td>
			<td style="width:135px;">150303</td>
			<td>temperature control</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:351px;">KMI53 Biological Micrometer Measuring Stage</td>
			<td style="width:124px;">Semprex</td>
			<td style="width:135px;">KMI53</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:351px;">High Performance DPSS Laser 532nm 50mW&#160;</td>
			<td style="width:124px;">Edmund optics</td>
			<td style="width:135px;">NT66-968</td>
			<td>Cy3 excitation</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:351px;">CUBE Fiber Pigtailed 640 nm, 30mW, Fiber, FC/APC Connector</td>
			<td style="width:124px;">Coherent</td>
			<td style="width:135px;">1139604</td>
			<td>Cy5 excitation</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:351px;">650 nm BrightLine Dichroic Beamsplitter</td>
			<td style="width:124px;">Semrock</td>
			<td style="width:135px;">FF650-Di01-25x36</td>
			<td>splitting dichroic</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:351px;">LaserMUX Beam Combiner, reflects 514.5, 532, &#38; 543.5 nm lasers, 25 mm</td>
			<td style="width:124px;">Semrock</td>
			<td style="width:135px;">LM01-552-25</td>
			<td>combining dichroic</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:351px;">Brightline Fluorescence Filter 593/40</td>
			<td style="width:124px;">Semrock</td>
			<td>FF01-593/40-25</td>
			<td>Cy3 emission filter</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:351px;">635 nm EdgeBasic LWP longpass Filter, 25 mm</td>
			<td style="width:124px;">Semrock</td>
			<td style="width:135px;">BLP01-635R-25</td>
			<td>Cy5 emission filter</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:351px;">EMCCD iXon+</td>
			<td style="width:124px;">Andor Technology</td>
			<td style="width:135px;">DU-897E-CS0-#BV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:351px;">IX51 inverted microscope frame</td>
			<td style="width:124px;">Olympus</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:351px;">Objective UApo N 100x/1.49 Oil TIRF</td>
			<td style="width:124px;">Olympus</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:351px;">Immersion oil type-F for fluorescence microscopy</td>
			<td style="width:124px;">Olympus</td>
			<td style="width:135px;">IMMOIL-F30CC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">2mm Diameter 45&#176; Rod Lens Aluminum Coated&#160;</td>
			<td style="width:124px;">Edmund optics</td>
			<td style="width:135px;">54-092</td>
			<td>miniature mirror</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">1/4&#34; Travel Single-Axis Translation Stage</td>
			<td style="width:124px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:135px;">MS-1</td>
			<td>translation of miniature mirror</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">&#216;1&#34; Achromatic Doublet, ARC: 400-700 nm, f=200 mm</td>
			<td style="width:124px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:135px;">AC254-200-A</td>
			<td>focusing lens</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:351px;">Adjustable Mechanical Slit</td>
			<td style="width:124px;">Thorlabs</td>
			<td>VA100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:351px;">Dielectric Mirror</td>
			<td style="width:124px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:135px;">BB1-E02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:351px;">&#216;1&#34; Achromatic Doublet, f = 100 mm</td>
			<td style="width:124px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:135px;">AC254-100-A</td>
			<td>relay lens</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:351px;">Lens Mount for &#216;1&#34; Optics</td>
			<td style="width:124px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:135px;">LMR1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:351px;">Dichroic Filter Mount</td>
			<td style="width:124px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:135px;">FFM1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:351px;">Fixed Cage Cube Platform</td>
			<td style="width:124px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:135px;">B3C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:351px;">Kinematic Mount for &#216;1&#34; Optics</td>
			<td style="width:124px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:135px;">KM100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:351px;">N-BK7 Plano-Convex Lens, &#216;1&#34;, f = 40 mm</td>
			<td style="width:124px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:135px;">LA1422-A</td>
			<td>collimating lens</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:351px;">N-BK7 Plano-Convex Lense, &#216;6.0 mm, f = 15 mm</td>
			<td style="width:124px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:135px;">LA1222-A</td>
			<td>telescope lens</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:351px;">N-BK7 Plano-Convex Lense, &#216;6.0 mm, f = 150 mm</td>
			<td style="width:124px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:135px;">LA1433-A</td>
			<td>telescope lens</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

studying dna looping by single-molecule fret

La flexion de l&#39;ADN double brin (ADNdb) est associée à de nombreux processus biologiques importants tels que la reconnaissance protéine-ADN et ADN emballage dans des nucléosomes. Thermodynamique de l&#39;ADN double brin de flexion a été étudiée par une méthode dite de cyclisation qui repose sur l&#39;ADN ligase pour joindre de manière covalente des extrémités cohésives courtes d&#39;un ADN double brin. Cependant, l&#39;efficacité de la ligature peut être affectée par de nombreux facteurs qui ne sont pas liés à ADN double brin boucle comme la structure de l&#39;ADN entourant les extrémités collantes jointes, et ligase peut également affecter le taux de boucle apparente à travers des mécanismes tels que la liaison non spécifique. Ici, nous montrons comment mesurer dsADN cinétique de boucle sans ligase en détectant transitoire formation de boucle d&#39;ADN par FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer). les molécules d&#39;ADNdb sont construites en utilisant un protocole simple basé sur la PCR avec une paire de FRET et une séquence de liaison à la biotine. La densité de probabilité de boucle connue comme le facteur J est extrait à partir de la vitesse en boucle et le taux d&#39;hybridation entre deux déconnexionextrémités cohésives TED. En testant deux dsDNAs avec des courbures différentes intrinsèques, on montre que le facteur de J est sensible à la forme intrinsèque de l&#39;ADN double brin.

molécules d&#39;ADN utilisées pour l&#39;étude de bouclage sont constitués d&#39;une région duplex de longueur et séquence variable et des surplombs simple brin qui sont complémentaires les unes aux autres. Les saillies, qui sont à base de temps 7, peuvent s&#39;hybrider à l&#39;autre pour capter l&#39;état de boucle. Chaque surplomb contient soit Cy3 ou Cy5 qui est lié à l&#39;ossature de l&#39;ADN grâce à la chimie amidite. Le Cy5-faux est également lié à la biotine-TEG (15 atome Tetra-éthylène glyc...

Watch this Scientific Journal Video about Studying DNA Looping by Single-Molecule FRET at JoVE.com

Studying DNA Looping by Single-Molecule FRET

Cette étude présente une procédure expérimentale détaillée pour mesurer la dynamique de boucle d&#39;ADN double-brin en utilisant une seule molécule Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET). Le protocole décrit également comment extraire la densité de probabilité boucle appelée facteur de J.

Étude de l&#39;ADN Looping par une seule molécule FRET

Bending of double-stranded DNA (dsDNA) is associated with many important biological processes such as DNA-protein recognition and DNA packaging into ...

studying-dna-looping-by-single-molecule-fret

Research

JoVE Journal

Biology

15.3K vues.  Georgia Institute of Technology.  Cette étude présente une procédure expérimentale détaillée pour mesurer la dynamique de boucle d'ADN double-brin en utilisant une seule molécule Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET). Le protocole décrit également comment extraire la densité de probabilité boucle appelée facteur de J. 