Pour commencer, installez un microscope fluorescent pour l’imagerie. Insérez une lame entièrement colorée avec des coupes de tissu immuno-colorant. Une fois l’objectif défini, appuyez sur le bouton live puis concentrez-vous sur l’échantillon.
Utilisez l’icône de mise à l’échelle automatique pour évaluer si les canaux sont suffisamment saturés de signal. Après avoir finalisé les paramètres du microscope, chargez le microscope avec les lames de contrôle couleur uniques. Concentrez-vous sur l’échantillon et appuyez sur l’option de début dans le menu Z-Stack pour commencer à configurer une Z-Stack.
Ensuite, concentrez-vous sur l’échantillon et appuyez sur l’option de fin. Pour la compensation de fluorescence des images, ouvrez l’une des images de contrôle uniques. Observez les fenêtres d’échelle de gris de chaque canal pour un signal dans un canal inapproprié.
Pour supprimer le fond perdu, entrez manuellement les chiffres dans la matrice, puis appuyez sur Appliquer pour vérifier s’il a été correctement éliminé. Ensuite, assemblez toutes les valeurs de chaque contrôle dans une seule matrice. Appliquez cette matrice sur un échantillon entièrement coloré.
Lancez le logiciel ilastik et ouvrez le fichier tiff des tissus. Cliquez sur l’onglet d’entraînement, puis utilisez l’outil pinceau pour mettre en surbrillance des cellules individuelles sur les images. Assurez-vous de mettre en évidence les cellules de manière à ce que l’intérieur et la membrane cellulaire soient inclus.
Ensuite, utilisez l’étiquette deux pour mettre en évidence tout ce qui n’est pas les cellules d’intérêt. Lancez maintenant le logiciel trois et ouvrez une image IMS du tissu contenant toutes les taches fluorescentes. Choisissez l’option masque sur noyaux comme canal source pour la détection des noyaux.
Sélectionnez ensuite l’option avancée pour diviser les noyaux par points d’amorçage. Définissez une valeur pour le diamètre du noyau. Examinez l’image à la recherche de cellules multiples fusionnées ou de cellules manquantes.
Cliquez ensuite sur l’objet cellules créées, puis sur l’onglet de création, puis sur l’option de stockage des paramètres pour le lot pour enregistrer les paramètres d’utilisation. Lancez Anaconda, puis JupyterLab dans Anaconda. Ouvrez le fichier de codage supplémentaire 1, puis appuyez sur exécuter toutes les cellules ou sur Exécuter les cellules sélectionnées dans le menu Exécuter.
Lorsqu’une invite s’affiche, entrez le répertoire de fichiers pour les valeurs fluorescentes exportées. Entrez ensuite le répertoire de fichiers pour n’importe quel emplacement approprié pour l’enregistrement des fichiers traités. Exécutez la section suivante du code pour annoter les données avec les noms de chaque canal.
Une fois qu’une stratégie de contrôle est établie, faites un clic droit sur population dans le menu, puis choisissez exporter. Exportez les paramètres sous forme de fichier csv avec les en-têtes inclus. Lancez à nouveau JupyterLab dans Anaconda.
Ouvrez ensuite le script dans le fichier de codage supplémentaire 2 et exécutez le code. Lorsque vous êtes invité à saisir l’emplacement du logiciel pour le fichier, entrez le répertoire des fichiers csv exportés. Ensuite, lorsque vous êtes invité à ajouter l’emplacement de sortie, choisissez le répertoire de fichiers de votre choix et assurez-vous que le répertoire de fichiers inclut le nom du fichier à la fin.
Exécutez le reste du code. Copiez maintenant le texte dans un fichier txt et ouvrez le fichier ims correspondant dans le logiciel trois. Cliquez sur l’objet cellule dans le fichier.
Passez à l’onglet statistiques, puis collez le texte dans la barre de recherche et lancez la recherche. Toutes les cellules d’intérêt seront maintenant mises en surbrillance. Les colorants fluorescents qui se chevauchaient spectralement ont été efficacement séparés dans le tissu qui a été coloré avec plusieurs colorants.
La séparation des colorants a clairement différencié différents types de cellules dans le tissu lymphatique. L’apprentissage automatique défini par l’utilisateur a été utilisé pour séparer les cellules, même lorsqu’elles étaient étroitement compactées les unes contre les autres.
