Richten Sie zunächst ein Fluoreszenzmikroskop für die Bildgebung ein. Führen Sie einen vollständig gefärbten Objektträger mit Immunfärbegewebeschnitten ein. Sobald das Objektiv eingestellt ist, drücken Sie die Live-Taste und fokussieren Sie sich dann auf die Probe.
Verwenden Sie das Symbol für die automatische Skalierung, um zu bewerten, ob die Kanäle ausreichend mit dem Signal gesättigt sind. Nachdem Sie die Mikroskopeinstellungen abgeschlossen haben, bestücken Sie das Mikroskop mit den einfarbigen Objektträgern. Fokussieren Sie unterhalb des Beispiels und drücken Sie die Option "Start" im Menü "Z-Stack", um mit der Einrichtung eines Z-Stacks zu beginnen.
Fokussieren Sie dann oberhalb des Beispiels und drücken Sie die Option Ende. Zur Fluoreszenzkompensation der Bilder öffnen Sie eines der einzelnen Kontrollbilder. Beobachten Sie die Graustufenfenster für jeden Kanal für ein Signal in einem ungeeigneten Kanal.
Um das Durchscheinen zu entfernen, geben Sie manuell Zahlen in die Matrix ein und drücken Sie dann auf Anwenden, um zu testen, ob es ausreichend entfernt wurde. Fügen Sie als Nächstes alle Werte aus den einzelnen Steuerelementen in einer einzelnen Matrix zusammen. Tragen Sie diese Matrix auf eine vollständig gefärbte Probe auf.
Starten Sie die ilastik-Software und öffnen Sie die tiff-Datei der Taschentücher. Klicken Sie auf die Registerkarte "Training" und verwenden Sie dann das Pinselwerkzeug, um einzelne Zellen auf den Bildern hervorzuheben. Achten Sie darauf, die Zellen so hervorzuheben, dass das Innere und die Zellmembran einbezogen werden.
Verwenden Sie als Nächstes die zweite Beschriftung, um alles hervorzuheben, was nicht die interessierenden Zellen sind. Starten Sie nun die dritte Software und öffnen Sie ein IMS-Bild des Gewebes, das alle fluoreszierenden Flecken enthält. Wählen Sie die Option "Maske über Kernen" als Quellkanal für die Kernerkennung.
Wählen Sie dann die erweiterte Option zum Aufteilen von Kernen nach Kernpunkten. Legen Sie einen Wert für den Kerndurchmesser fest. Untersuchen Sie das Bild auf verschmolzene mehrere Zellen oder fehlende Zellen.
Klicken Sie dann auf das erstellte Zellenobjekt, gefolgt von der Registerkarte Erstellung und dann auf die Option Parameter für Batch speichern, um die Verwendungseinstellungen zu speichern. Starten Sie Anaconda und dann JupyterLab innerhalb von Anaconda. Öffnen Sie die ergänzende Codierungsdatei 1 und drücken Sie dann im Ausführungsmenü auf Alle Zellen ausführen oder ausgewählte Zellen ausführen.
Wenn eine Eingabeaufforderung angezeigt wird, geben Sie das Dateiverzeichnis für die exportierten Fluoreszenzwerte ein. Geben Sie dann das Dateiverzeichnis für einen beliebigen Speicherort ein, der zum Speichern der verarbeiteten Dateien geeignet ist. Führen Sie den nächsten Abschnitt des Codes aus, um die Daten mit den Namen der einzelnen Kanäle zu versehen.
Sobald eine Gating-Strategie festgelegt ist, klicken Sie mit der rechten Maustaste auf Population im Menü und wählen Sie dann Exportieren. Exportieren Sie die Parameter als CSV-Datei mit den enthaltenen Headern. Starten Sie JupyterLab erneut in Anaconda.
Öffnen Sie dann das Skript in der ergänzenden Codierungsdatei 2, und führen Sie den Code aus. Wenn Sie aufgefordert werden, den Speicherort der Software für die Datei einzugeben, geben Sie das Dateiverzeichnis der exportierten CSV-Dateien ein. Wenn Sie als Nächstes aufgefordert werden, den Ausgabespeicherort hinzuzufügen, wählen Sie ein Dateiverzeichnis Ihrer Wahl aus und stellen Sie sicher, dass das Dateiverzeichnis den Namen der Datei am Ende enthält.
Führen Sie den Rest des Codes aus. Kopieren Sie nun den Text in eine txt-Datei und öffnen Sie die entsprechende ims-Datei in software three. Klicken Sie auf das Zellenobjekt in der Datei.
Wechseln Sie zur Registerkarte Statistiken, fügen Sie den Text in die Suchleiste ein und starten Sie die Suche. Alle Zellen, die Sie interessieren, werden nun hervorgehoben. Spektral überlappende Fluoreszenzfarbstoffe wurden in dem Gewebe, das mit mehreren Farbstoffen gefärbt wurde, effektiv getrennt.
Durch die Trennung der Farbstoffe konnten verschiedene Zelltypen im Lymphgewebe deutlich unterschieden werden. Mithilfe von benutzerdefiniertem maschinellem Lernen wurden die Zellen auch dann getrennt, wenn sie dicht beieinander lagen.
