Pour commencer, énucléez les globes oculaires de la souris euthanasiée et homogénéisez les yeux dans un tampon glacé. Centrifuger l’homogénat à 16 000 G pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius. Jetez le surnageant contenant des protéines solubles dans l’eau et d’autres contaminants.
Ensuite, remettez en suspension et solubilisez la membrane granulée et les protéines membranaires dans un tampon pendant une heure à quatre degrés Celsius sur une plate-forme rotative. Ensuite, centrifuger la fraction membranaire résoluble pendant une heure à 16 000 G à quatre degrés Celsius. Mélangez le surnageant avec 30 à 50 microlitres de billes d’anticorps Rho1D4 et des billes d’anticorps d’immunoglobuline G vierges dans deux échantillons indépendants distincts et incubez pendant une heure à quatre degrés Celsius sur une plate-forme rotative.
À l’aide d’un support magnétique, séparez le pull-down en recueillant les billes. Jetez le surnageant et lavez les billes avec un tampon à haute et à faible teneur en sel contenant du Bis-tris propane, du chlorure de sodium et du N-dodécyl-bêta-D-maltoside. Pour éluer la protéine de rhodopsine, incubez les billes pendant cinq à 10 minutes à température ambiante avec un tampon de 65 microlitres de la composition donnée.
Ensuite, à l’aide d’une coudée de quartz rectangulaire submicro de 50 microlitres avec une ouverture de deux millimètres et une longueur de trajet de 10 millimètres, analysez l’absorbance de l’éluat de 200 nanomètres à 800 nanomètres dans un réglage de balayage rapide avec un spectrophotomètre. Pour valider et déterminer la qualité, exposez l’éluat à une lumière vive pendant une minute. Répétez ensuite la mesure de l’absorbance.
Soustrayez l’absorbance à blanc et calculez le rapport des spectres absorbants analysés. Ensuite, tracez les spectres absorbants soustraits et calculez la valeur d’opsine libre. Ensuite, en utilisant la loi de Beer-Lambert, calculez la concentration de rhodopsine, puis calculez la concentration d’opsine sans ligand, et estimez la différence de concentration pour l’apo-opsine et l’opsine sans ligand en quantité et en pourcentage.
