Nous tenons à remercier les membres du Vancouver Institute of Visual Analytics (VIVA) pour offrir des commentaires et des conseils pour le projet. En particulier, nous tenons à remercier John Dill, Brian Fisher et David Darvill. Nous tenons également à remercier les membres du laboratoire de Kollmann pour leur soutien et des discussions utiles. Ce travail a été soutenu en partie par l&#39;Institut national des allergies et des maladies infectieuses, Institut national de santé Grant AI50023 N01; subventions des RCE AllerGen 07-07-A1A et B2B, et la Fondation Michael Smith pour la recherche en santé. TRK est soutenu en partie par une bourse de carrière dans les sciences biomédicales de l&#39;annonce du Burroughs Wellcome Fund par une subvention des Instituts canadiens de recherche en santé Formation Programme de santé des enfants canadiens clinicien-chercheur, en partenariat avec Sick Kids Foundation-, Child and Family Research Institute ( Colombie-Britannique), Femmes et Enfants Health Research Institute (Alberta), et au Manitoba Institute of Child Health.

1. Exploration de l&#39;analyse comparative sur le Tableau <ol><li> Vous disposez d&#39;un ensemble de données et que vous voulez explorer les différentes relations entre les colonnes dans les données. <ol><li> (Figure 1) Importer les données en cliquant sur «Se connecter aux données». Choisissez le type de source de données et suivez les instructions pour importer vos données. </li><li> (Figure 1) Assurez-vous que le plateau des dimensions contient des colonnes catégorielles tout le plateau de mesures contient des colonnes numériques de votre dataset. Parfois, une colonne de dimension tels que le code objet peut être répertorié comme mesure, si elle est numérotée. Changez les dimensions en cliquant-droit dessus et sélectionnez &quot;Convertir en dimension. Dans la figure 1, colonnes catégorique de l&#39;ensemble de données tels que le niveau de concentration de relance et les identificateurs de l&#39;objet sont correctement placés dans étagères dimensions, et la concentration observée de cytokines sont correctement placés dans des mesures de conservation. </li><li> (Figure 2) Si, durant le processus d&#39;analyse, un champ calculé est nécessaire, il suffit de faire un clic droit dans les deux dimensions ou une étagère mesures, et sélectionnez &quot;Créer un champ calculé. Entrée dans le calcul de la zone de formule avec des champs combinée avec les fonctions ou des opérations mathématiques. La figure 2 montre comment créer un nouveau champ appelé VFI&gt; 2 en agrégeant PFD2, PFD3 et PFD4 valeurs. </li><li> (Figure 3) Générer une parcelle en 2-D dans le Tableau, généralement avec une dimension et une mesure d&#39;intérêt. Depuis l&#39;interface offre un simple glisser-déposer d&#39;interaction, le choix de la dimension et la mesure peut être facilement changée. Les dimensions sont généralement placés dans des étagères des colonnes et des mesures de conservation des lignes. Dans la figure 3, le plateau des dimensions contient le niveau de concentration de relance, et la tablette contient des mesures niveau de concentration observée de cytokines. </li><li> (Figure 3) Afin de différencier la visualisation d&#39;une dimension spécifique, placez cette étiquette dimension étagère texte, la couleur ou la taille, selon la nature de la dimension. Étagères texte tente de différencier les données dans la visualisation en les étiquetant avec des informations textuelles fournies par la dimension sélectionnée. Étagères couleur et la taille de différencier automatiquement les données par couleur et par taille, qui peut être réglé avec la barre de défilement située en bas de chaque étagère. Dans la figure 3, en plaçant le génotype étagère de couleur conduit à la séparation des trois génotypes par des couleurs distinctes. </li><li> (Figure 3) Filtre la visualisation par les variables de colonne spécifique dans une autre dimension. Cela peut être fait en faisant glisser l&#39;étiquette de dimension dans le plateau du filtre. Une fenêtre apparaîtra avec la liste des valeurs à choisir. La valeur sélectionnée sera les seules valeurs restantes dans la visualisation. </li><li> (Figure 4) Vous pouvez combiner visualisation avec une autre dimension ou d&#39;une mesure de produire une matrice de visualisation. Cela peut être fait en laissant tomber les multiples dimensions de conservation des colonnes et des mesures multiples dans le rayon des lignes. La figure 4 contient un exemple de deux-colonne de la matrice de visualisation en plaçant deux dimensions différentes dans le plateau colonnes. </li><li> Pour produire une visualisation semblables, faites un clic droit sur la feuille en cours sur le coin inférieur gauche, et choisis &quot;feuille de duplicata». </li><li> Itérer le processus d&#39;analyse pour identifier les tendances intéressantes ou aberrantes qui peuvent vous aider à générer de nouvelles hypothèses sur les données. </li></ol></li><li> Vous avez plusieurs données générées à partir de la même source, et que vous voulez explorer les liens possibles entre ces ensembles de données. <ol><li> Placez les ensembles de données multiples dans un même source, le lieu soit deux feuilles de calcul dans le même classeur, pour permettre Tableau de se connecter à ces données par la même connexion. </li><li> (Figure 5) Connecter les ensembles de données grâce à rejoindre logique des valeurs clés, en s&#39;assurant que les dimensions qui sont les mêmes pour plusieurs ensembles de données sont sélectionnés. Dans la figure 5, il ya cinq valeurs clés pour joindre: identificateur du type de cellule, le niveau de concentration de relance, le stade ou à un groupe, de relance, et le sujet. </li><li> Effectuer une analyse similaire à l&#39;article 1.1. </li></ol></li></ol> 2. Présentation basée sur les besoins <ol><li> Vous savez les relations entre les données, mais vous voulez être en mesure de générer rapidement une liste des visualisations pour une utilisation dans la présentation. <ol><li> Suivre le protocole décrit à la section 1.1, et d&#39;annoter les visualisations en conséquence. </li><li> Utilisez la fonction d&#39;exportation dans le Tableau de produire des images de visualisations. </li></ol></li><li> Vous avez généré un ensemble de visualisations puissant classeur Tableau et veulent partager ce classeur. <ol><li> Enregistrez le classeur en tant que classeur Tableau emballés et partager ce fichier. </li><li> Collègues de bureau, sans Tableau pouvez télécharger lecteur Tableau pour ouvrir le classeur emballés. Lecteur Tableau permet à vos collègues d&#39;interagir avec les visualisations que vous avez créés. </li></ol></li></ol> 3. Les résultats représentatifs <img src="/files/ftp_upload/2397/2397fig1.jpg" alt="Figure 1" /> Figure 1. Une capture d&#39;écranTableau d&#39;après l&#39;importation du tableur appelé NFKBIA du demo.xls fichier Excel. Les dimensions et les étagères des mesures ont été correctement remplies avec les données catégoriques et numériques, respectivement. <img src="/files/ftp_upload/2397/2397fig2.jpg" alt="Figure 2" /> Figure 2. La fenêtre champ calculé est appelé pour créer un champ spécial calculée à utiliser dans le Tableau. La liste sur le fond à gauche la boîte permet d&#39;identifier les champs du possible, et la liste sur le côté droit contient abréviation de fonctions qui peuvent être utilisés dans la formule. Dans cet exemple, nous avons voulu ajouter les valeurs pour PFD4, PFD3 et PFD2 pour obtenir la valeur finale que nous appelons VFI&gt; 2 <img src="/files/ftp_upload/2397/2397fig3.jpg" alt="Figure 3" /> Figure 3. Visualisation des niveaux de concentration de relance fonction de la concentration des cytokines observées. La visualisation montre un tracé des niveaux de concentration différents du stimulus 3M-002 contre la concentration observée de la cytokine TNF-α. Les couleurs des lignes se réfèrent à différents génotypes pour un polymorphisme nucléotidique du gène NFKBIA des individus dans notre étude immunitaire inné. <img src="/files/ftp_upload/2397/2397fig4.jpg" alt="Figure 4" /> Figure 4. Une capture d&#39;écran d&#39;une matrice de visualisation à deux colonnes. Nous avons généré une matrice à deux colonnes pour faciliter une comparaison côte à côte des réponses aux deux stimuli, 3M-003 et LPS. Le x-axes sont les niveaux de concentration différents de ces deux stimuli, et les parcelles axe y les valeurs du champ calculé, VFI&gt; 2. <img src="/files/ftp_upload/2397/2397fig5.jpg" alt="Figure 5" /> Figure 5. Ces fenêtres de dialogue Tableau illustrent comment connecter les données enregistrées dans des feuilles de calcul différentes. Connexion de données à partir des feuilles de calcul différente peut être accomplie en combinant ces logiques en utilisant des clauses JOIN de valeurs clés. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td colspan="10"> Outil de visualisation et d&#39;analyse </td></tr><tr><td> Fonction </td><td> Tableau </td><td> VIS-STAMP </td><td> xmdvtool </td><td> Ggobi </td><td> Lumière des étoiles </td><td> Gapminder </td><td> Visulab </td><td> InfoVis Toolkit </td><td> Geotime </td><td> Inspirent </td></tr><tr><td> Tracés parallèles de coordonnées </td><td> Oui </td><td> Oui </td><td> Oui </td><td> Oui </td><td> Oui </td><td> Aucun </td><td> Oui </td><td> Oui </td><td> Aucun </td><td> Aucun </td></tr><tr><td> Matrices nuage de points </td><td> Oui </td><td> Aucun </td><td> Oui </td><td> Oui </td><td> Oui </td><td> Aucun </td><td> Oui </td><td> Aucun </td><td> Aucun </td><td> Aucun </td></tr><tr><td> Réduction dimensionnelle </td><td> Aucun </td><td> Aucun </td><td> Oui </td><td> Oui </td><td> Aucun </td><td> Aucun </td><td> Aucun </td><td> Aucun </td><td> Aucun </td><td> Aucun </td></tr><tr><td> Les dimensions temporelle </td><td> Oui </td><td> Oui </td><td> Aucun </td><td> Oui </td><td> Oui </td><td> Oui </td><td> Aucun </td><td> Oui </td><td> Oui </td><td> Aucun </td></tr><tr><td> Les dimensions géospatiales </td><td> Oui </td><td> Oui </td><td> Aucun </td><td> Aucun </td><td> Oui </td><td> Oui </td><td> Aucun </td><td> Aucun </td><td> Oui </td><td> Aucun </td></tr><tr><td> Le text mining </td><td> Aucun </td><td> Aucun </td><td> Aucun </td><td> Aucun </td><td> Oui </td><td> Aucun </td><td> Aucun </td><td> Aucun </td><td> Aucun </td><td> Oui </td></tr><tr><td> La manipulation directe des données </td><td> Oui </td><td> Oui </td><td> Oui </td><td> Oui </td><td> Oui </td><td> Oui </td><td> Oui </td><td> Aucun </td><td> Oui </td><td> Aucun </td></tr><tr><td> Filtrage </td><td> Oui </td><td> Oui </td><td> Oui </td><td> Oui </td><td> Oui </td><td> Oui </td><td> Oui </td><td> Aucun </td><td> Oui </td><td> Oui </td></tr><tr><td> Extensibilité à d&#39;autres plateformes (par exemple, R) </td><td> Oui </td><td> Aucun </td><td> Oui </td><td> Oui </td><td> Aucun </td><td> Oui </td><td> Aucun </td><td> Oui </td><td> Aucun </td><td> Aucun </td></tr><tr><td> Formats de tableau CSV </td><td> Oui </td><td> Oui </td><td> Oui </td><td> Oui </td><td> Aucun </td><td> Aucun </td><td> Oui </td><td> Oui </td><td> Oui </td><td> Aucun </td></tr><tr><td> XML des formats de données </td><td> Oui </td><td> Aucun </td><td> Aucun </td><td> Oui </td><td> Oui </td><td> Aucun </td><td> Oui </td><td> Oui </td><td> Oui </td><td> Aucun </td></tr><tr><td> Peut se débrouiller dans une0000 + lignes </td><td> Oui </td><td> Aucun </td><td> Aucun </td><td> Aucun </td><td> Oui </td><td> Aucun </td><td> Aucun </td><td> Aucun </td><td> Aucun </td><td> Oui </td></tr><tr><td> Documentation </td><td> Oui </td><td> Oui </td><td> Oui </td><td> Oui </td><td> Oui </td><td> Oui </td><td> Oui </td><td> Oui </td><td> Oui </td><td> Oui </td></tr><tr><td> Le produit commercial </td><td> Oui </td><td> Aucun </td><td> Aucun </td><td> Aucun </td><td> Oui </td><td> Aucun </td><td> Aucun </td><td> Aucun </td><td> Oui </td><td> Oui </td></tr></tbody></table> Tableau 1. Liste des outils d&#39;analyse visuelle et certaines de leurs caractéristiques.

<ol>
	<li>Thomas, J., Cook, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Illuminating+the+Path:+The+Research+and+Development+Agenda+for+Visual+Analytics.">Illuminating the Path: The Research and Development Agenda for Visual Analytics.</a> , (2005).</li><li>Steed, C., Swan, J., Jankun-Kelly, T., Fitzpatrick, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guided+Analysis+of+Hurricane+Trends+Using+Statistical+Processes+Integrated+with+Interactive+Parallel+Coordinates.">Guided Analysis of Hurricane Trends Using Statistical Processes Integrated with Interactive Parallel Coordinates.</a> IEEE Symposium on Visual Analytics Science and Technology. , 19-26 (2009).</li><li>Saraiya, P., North, C., Lam, V., Duca, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Insight-Based+Longitudinal+Study+of+Visual+Analytics.">An Insight-Based Longitudinal Study of Visual Analytics.</a> IEEE Transactions on Visualization and Computer Graphics. 12, 1511-1522 (2006).</li><li>Kollmann, T. R., Crabtree, J., Rein-Weston, A., Blimkie, D., Thommai, F., Wang, X. Y., Lavoie, P. M., Furlong, J., Fortuno, E. S., Hajjar, A. M., Hawkins, N. R., Self, S. G., Wilson, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neonatal+innate+TLR-mediated+responses+are+distinct+from+those+of+adults.">Neonatal innate TLR-mediated responses are distinct from those of adults.</a> J. Immunol. 183, 7150-7160 (2009).</li></ol>

L&#39;avènement de la technologie à haut débit dans la recherche biomédicale moderne, conduit à une explosion des données de recherche qui nécessite un moyen plus efficace de l&#39;analyse. Visuel Analytics (VA) est la science du raisonnement analytique facilité par les interfaces visuelles interactives (1). L&#39;approche VA restaure la puissance analytique dans les mains de l&#39;analyste humains, contrairement à l&#39;approche traditionnelle de détecter des modèles par ordinateur. Visuel d&#39;analyse a é...

facilitating the analysis of immunological data with visual analytic techniques

Visuel Analytics (VA) a émergé comme une nouvelle manière d&#39;analyser grande base de données grâce à l&#39;affichage visuel interactif. Nous avons démontré l&#39;utilité et la souplesse d&#39;une approche de VA dans l&#39;analyse des ensembles de données biologiques. Des exemples de ces ensembles de données en immunologie incluent la cytométrie de flux, les données Luminex, et le génotypage (par exemple, single nucleotide polymorphism) des données. Contrairement à l&#39;approche de visualisation d&#39;information traditionnels, VA restaure la puissance d&#39;analyse dans les mains de l&#39;analyste, en permettant à l&#39;analyste de se livrer en temps réel processus d&#39;exploration de données. Nous avons choisi le logiciel VA appelé Tableau après avoir évalué plusieurs outils VA. Deux types de tâches d&#39;analyse d&#39;analyse au sein et entre les ensembles de données ont été démontrées dans la vidéo de présentation en utilisant une approche appelée analyse appariés. L&#39;analyse par paires, comme défini dans VA, est une approche d&#39;analyse dans lequel un expert outil de VA travaille côte à côte avec un expert du domaine lors de l&#39;analyse. L&#39;expert du domaine est celui qui comprend la signification des données, et pose les questions que les données recueillies pourraient adresse. L&#39;expert outil crée ensuite des visualisations pour aider à trouver des modèles dans les données qui pourraient répondre à ces questions. Le court temps de latence entre la génération d&#39;hypothèses et de l&#39;affichage visuel rapide des données est le principal avantage d&#39;une approche VA.

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Facilitating the Analysis of Immunological Data with Visual Analytic Techniques

Visuel Analytics (VA) est une nouvelle approche d&#39;analyse des données de manière interactive. Dans cette vidéo, nous abordons le problème de surcharge de données provoquée par haut-débit les expériences biologiques, et de proposer VA comme une solution à ces problèmes. La vidéo démontre l&#39;analyse au sein et entre les ensembles de données immunologiques utilisant un outil appelé VA Tableau.

Faciliter l&#39;analyse des données immunologiques avec Visual techniques analytiques

Visual analytics (VA) has emerged as a new way to analyze large dataset through interactive visual display. We demonstrated the utility and the ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

10.0K vues.  University of British Columbia. Visuel Analytics (VA) est une nouvelle approche d'analyse des données de manière interactive. Dans cette vidéo, nous abordons le problème de surcharge de données provoquée par haut-débit les expériences biologiques, et de proposer VA comme une solution à ces problèmes. La vidéo démontre l'analyse au sein et entre les ensembles de données immunologiques utilisant un outil appelé VA Tableau.

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Facilitating Drug Discovery: An Automated High-content Inflammation Assay in Zebrafish

Zebrafish larvae are particularly amenable to whole animal small molecule screens1,2 due to their small size and relative ease of manipulation and observation, as well as the fact that compounds can simply be added to the bathing water and are readily absorbed when administered in a &lt;1% DMSO solution. Due to the optical clarity of zebrafish larvae and the availability of transgenic lines expressing fluorescent proteins in leukocytes, zebrafish offer the unique advantage of monitoring an acute inflammatory response in vivo. Consequently, utilizing the zebrafish for high-content small molecule screens aiming at the identification of immune-modulatory compounds with high throughput has been proposed3-6, suggesting inflammation induction scenarios e.g. localized nicks in fin tissue, laser damage directed to the yolk surface of embryos7 or tailfin amputation3,5,6. The major drawback of these methods however was the requirement of manual larva manipulation to induce wounding, thus preventing high-throughput screening. Introduction of the chemically induced inflammation (ChIn) assay8 eliminated these obstacles. Since wounding is inflicted chemically the number of embryos that can be treated simultaneously is virtually unlimited. Temporary treatment of zebrafish larvae with copper sulfate selectively induces cell death in hair cells of the lateral line system and results in rapid granulocyte recruitment to injured neuromasts. The inflammatory response can be followed in real-time by using compound transgenic cldnB::GFP/lysC::DsRED26,9 zebrafish larvae that express a green fluorescent protein in neuromast cells, as well as a red fluorescent protein labeling granulocytes.
In order to devise a screening strategy that would allow both high-content and high-throughput analyses we introduced robotic liquid handling and combined automated microscopy with a custom developed software script. This script enables automated quantification of the inflammatory response by scoring the percent area occupied by red fluorescent leukocytes within an empirically defined area surrounding injured green fluorescent neuromasts. Furthermore, we automated data processing, handling, visualization, and storage all based on custom developed MATLAB and Python scripts.
In brief, we introduce an automated HC/HT screen that allows testing of chemical compounds for their effect on initiation, progression or resolution of a granulocytic inflammatory response. This protocol serves a good starting point for more in-depth analyses of drug mechanisms and pathways involved in the orchestration of an innate immune response. In the future, it may help identifying intolerable toxic or off-target effects at earlier phases of drug discovery and thereby reduce procedural risks and costs for drug development.

Here we describe a novel high-content chemically induced inflammation assay aiming at the identification of immune-modulatory bioactives. We have successfully combined automated microscopy with custom developed software scripts enabling automated quantification of the inflammatory response as well as further data processing, analysis, mining, and storage.

Drug faciliter la découverte: Un test automatisé inflammation Haute-contenu chez le poisson zèbre

Zebrafish larvae are particularly amenable to whole animal small molecule screens1,2 due to their small size and relative ease of manipulation and ...

Recherche

Immunologie et infection

Visualization of the Immunological Synapse by Dual Color Time-gated Stimulated Emission Depletion (STED) Nanoscopy

Natural killer cells form tightly regulated, finely tuned immunological synapses (IS) in order to lyse virally infected or tumorigenic cells. Dynamic actin reorganization is critical to the function of NK cells and the formation of the IS. Imaging of F-actin at the synapse has traditionally utilized confocal microscopy, however the diffraction limit of light restricts resolution of fluorescence microscopy, including confocal, to approximately 200 nm. Recent advances in imaging technology have enabled the development of subdiffraction limited super-resolution imaging. In order to visualize F-actin architecture at the IS we recapitulate the NK cell cytotoxic synapse by adhering NK cells to activating receptor on glass. We then image proteins of interest using two-color stimulated emission depletion microscopy (STED). This results in &#60;80 nm resolution at the synapse. Herein we describe the steps of sample preparation and the acquisition of images using dual color STED nanoscopy to visualize F-actin at the NK IS. We also illustrate optimization of sample acquisition using Leica SP8 software and time-gated STED. Finally, we utilize Huygens software for post-processing deconvolution of images.

Visualization of the Immunological Synapse by Dual Color Time-gated Stimulated Emission Depletion STED Nanoscopy

Here we illustrate the protocol for imaging by two-color STED nanoscopy the cytotoxic immune synapse of NK cells recapitulated on glass. Using this method we obtain sub-100 nm resolution of synapse proteins and the cytoskeleton.

Visualisation du immunologique Synapse par double couleur Temps-dépendants émission stimulée épuisement (STED) nanoscopie

Natural killer cells form tightly regulated, finely tuned immunological synapses (IS) in order to lyse virally infected or tumorigenic cells. Dynamic ...

Super-resolution Imaging of the Natural Killer Cell Immunological Synapse on a Glass-supported Planar Lipid Bilayer

The glass-supported planar lipid bilayer system has been utilized in a variety of disciplines. One of the most useful applications of this technique has been in the study of immunological synapse formation, due to the ability of the glass-supported planar lipid bilayers to mimic the surface of a target cell while forming a horizontal interface. The recent advances in super-resolution imaging have further allowed scientists to better view the fine details of synapse structure. In this study, one of these advanced techniques, stimulated emission depletion (STED), is utilized to study the structure of natural killer (NK) cell synapses on the supported lipid bilayer. Provided herein is an easy-to-follow protocol detailing: how to prepare raw synthetic phospholipids for use in synthesizing glass-supported bilayers; how to determine how densely protein of a given concentration occupies the bilayer's attachment sites; how to construct a supported lipid bilayer containing antibodies against NK cell activating receptor CD16; and finally, how to image human NK cells on this bilayer using STED super-resolution microscopy, with a focus on distribution of perforin positive lytic granules and filamentous actin at NK synapses. Thus, combining the glass-supported planar lipid bilayer system with STED technique, we demonstrate the feasibility and application of this combined technique, as well as intracellular structures at NK immunological synapse with super-resolution.

We describe here a combination of the glass-supported lipid bilayer technique of forming immunological synapses with the super-resolution imaging technique of stimulated emission depletion (STED) microscopy. The goal of this protocol is to provide users with the instructions necessary to successfully carry out these two techniques.

Super-résolution de l&#39;imagerie cellulaire Synapse immunologique Natural Killer sur un verre soutenu par Planar lipidique en deux couches

The glass-supported planar lipid bilayer system has been utilized in a variety of disciplines. One of the most useful applications of this technique has ...

An Endothelial Planar Cell Model for Imaging Immunological Synapse Dynamics

Adaptive immunity is regulated by dynamic interactions between T cells and antigen presenting cells (&#39;APCs&#39;) referred to as &#39;immunological synapses&#39;. Within these intimate cell-cell interfaces discrete sub-cellular clusters of MHC/Ag-TCR, F-actin, adhesion and signaling molecules form and remodel rapidly. These dynamics are thought to be critical determinants of both the efficiency and quality of the immune responses that develop and therefore of protective versus pathologic immunity. Current understanding of immunological synapses with physiologic APCs is limited by the inadequacy of the obtainable imaging resolution. Though artificial substrate models (e.g., planar lipid bilayers) offer excellent resolution and have been extremely valuable tools, they are inherently non-physiologic and oversimplified. Vascular and lymphatic endothelial cells have emerged as an important peripheral tissue (or stromal) compartment of &#39;semi-professional APCs&#39;. These APCs (which express most of the molecular machinery of professional APCs) have the unique feature of forming virtually planar cell surface and are readily transfectable (e.g., with fluorescent protein reporters). Herein a basic approach to implement endothelial cells as a novel and physiologic &#39;planar cellular APC model&#39; for improved imaging and interrogation of fundamental antigenic signaling processes will be described.

Adaptive immunity is controlled by dynamic 'immunological synapses' formed between T cells and antigen presenting cells. This protocol describes methods for investigating endothelial cells both as understudied physiologic APCs and as a novel type of 'planar cellular APC model'.

Une cellule endothéliale Planar Modèle for Imaging Dynamics Synapse immunologique

Adaptive immunity is regulated by dynamic interactions between T cells and antigen presenting cells (&#39;APCs&#39;) referred to as &#39;immunological ...

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte extravasation might result in pathophysiological changes in the CNS. Thus, investigation of lymphocyte migration into the CNS is important to understand inflammatory CNS diseases and to develop new therapy approaches. Here we present an in vitro model of the human blood-brain barrier to study lymphocyte extravasation. Human brain microvascular endothelial cells (HBMEC) are confluently grown on a porous polyethylene terephthalate transwell insert to mimic the endothelium of the blood-brain barrier. Barrier function is validated by zonula occludens immunohistochemistry, transendothelial electrical resistance (TEER) measurements as well as analysis of evans blue permeation. This model allows investigation of the diapedesis of rare lymphocyte subsets such as CD56brightCD16dim/- NK cells. Furthermore, the effects of other cells, cytokines and chemokines, disease-related alterations, and distinct treatment regimens on the migratory capacity of lymphocytes can be studied. Finally, the impact of inflammatory stimuli as well as different treatment regimens on the endothelial barrier can be analyzed.

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Here, we describe a human blood-brain barrier model enabling to investigate lymphocyte transmigration into the central nervous system in vitro.

Analyse des Lymphocytes extravasation L&#39;utilisation d&#39;un<em&gt; In vitro</em&gt; Modèle de la barrière hématoencéphalique humaine

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte ...

ExCYT: A Graphical User Interface for Streamlining Analysis of High-Dimensional Cytometry Data

With the advent of flow cytometers capable of measuring an increasing number of parameters, scientists continue to develop larger panels to phenotypically explore characteristics of their cellular samples. However, these technological advancements yield high-dimensional data sets that have become increasingly difficult to analyze objectively within traditional manual-based gating programs. In order to better analyze and present data, scientists partner with bioinformaticians with expertise in analyzing high-dimensional data to parse their flow cytometry data. While these methods have been shown to be highly valuable in studying flow cytometry, they have yet to be incorporated in a straightforward and easy-to-use package for scientists who lack computational or programming expertise. To address this need, we have developed ExCYT, a MATLAB-based Graphical User Interface (GUI) that streamlines the analysis of high-dimensional flow cytometry data by implementing commonly employed analytical techniques for high-dimensional data including dimensionality reduction by t-SNE, a variety of automated and manual clustering methods, heatmaps, and novel high-dimensional flow plots. Additionally, ExCYT provides traditional gating options of select populations of interest for further t-SNE and clustering analysis as well as the ability to apply gates directly on t-SNE plots. The software provides the additional advantage of working with either compensated or uncompensated FCS files. In the event that post-acquisition compensation is required, the user can choose to provide the program a directory of single stains and an unstained sample. The program detects positive events in all channels and uses this select data to more objectively calculate the compensation matrix. In summary, ExCYT provides a comprehensive analysis pipeline to take flow cytometry data in the form of FCS files and allow any individual, regardless of computational training, to use the latest algorithmic approaches in understanding their data.

ExCYT is a MATLAB-based Graphical User Interface (GUI) that allows users to analyze their flow cytometry data via commonly employed analytical techniques for high-dimensional data including dimensionality reduction via t-SNE, a variety of automated and manual clustering methods, heatmaps, and novel high-dimensional flow plots.

ExCYT : Une Interface graphique pour simplifier Analysis of High-Dimensional Data de cytométrie en flux

With the advent of flow cytometers capable of measuring an increasing number of parameters, scientists continue to develop larger panels to phenotypically ...

Complementary Use of Microscopic Techniques and Fluorescence Reading in Studying Cryptococcus-Amoeba Interactions

To simulate Cryptococcus infection, amoeba, which is the natural predator of cryptococcal cells in the environment, can be used as a model for macrophages. This predatory organism, similar to macrophages, employs phagocytosis to kill internalized cells. With the aid of a confocal laser-scanning microscope, images depicting interactive moments between cryptococcal cells and amoeba are captured. The resolution power of the electron microscope also helps to reveal the ultrastructural detail of cryptococcal cells when trapped inside the amoeba food vacuole. Since phagocytosis is a continuous process, quantitative data is then integrated in the analysis to explain what happens at the timepoint when an image is captured. To be specific, relative fluorescence units are read in order to quantify the efficiency of amoeba in internalizing cryptococcal cells. For this purpose, cryptococcal cells are stained with a dye that makes them fluoresce once trapped inside the acidic environment of the food vacuole. When used together, information gathered through such techniques can provide critical information to help draw conclusions on the behavior and fate of cells when internalized by amoeba and, possibly, by other phagocytic cells.

Complementary Use of Microscopic Techniques and Fluorescence Reading in Studying Cryptococcus-Amoeba Interactions

This paper details a protocol for preparing a co-culture of cryptococcal cells and amoebae that is studied using still, fluorescent images and high-resolution transmission electron microscope images. Illustrated here is how quantitative data can complement such qualitative information.

Utilisation complémentaire des techniques microscopiques et de la lecture de fluorescence dans l'étude des interactions Cryptococcus-Amoeba

To simulate Cryptococcus infection, amoeba, which is the natural predator of cryptococcal cells in the environment, can be used as a model for ...

Opsonophagocytic Killing Assay to Assess Immunological Responses Against Bacterial Pathogens

A key aspect of the immune response to bacterial colonization of the host is phagocytosis. An opsonophagocytic killing assay (OPKA) is an experimental procedure in which phagocytic cells are co-cultured with bacterial units. The immune cells will phagocytose and kill the bacterial cultures in a complement-dependent manner. The efficiency of the immune-mediated cell killing is dependent on a number of factors and can be used to determine how different bacterial cultures compare with regard to resistance to cell death. In this way, the efficacy of potential immune-based therapeutics can be assessed against specific bacterial strains and/or serotypes. In this protocol, we describe a simplified OPKA that utilizes basic culture conditions and cell counting to determine bacterial cell viability after co-culture with treatment conditions and HL-60 immune cells. This method has been successfully utilized with a number of different pneumococcal serotypes, capsular and acapsular strains, and other bacterial species. The advantages of this OPKA protocol are its simplicity, versatility (as this assay is not limited to antibody treatments as opsonins), and minimization of time and reagents to assess basic experimental groups.

This opsonophagocytic killing assay is used to compare the ability of phagocytic immune cells to respond to and kill bacteria based on different treatments and/or conditions. Classically, this assay serves as the gold&#160;standard for assessing effector functions of antibodies raised against a bacterium as opsonin.

Opsonophagocytic meurtre dosage pour évaluer les réponses immunologiques contre les bactéries pathogènes

A key aspect of the immune response to bacterial colonization of the host is phagocytosis. An opsonophagocytic killing assay (OPKA) is an experimental ...

Application of Consistent Massage-Like Perturbations on Mouse Calves and Monitoring the Resulting Intramuscular Pressure Changes

Massage is generally recognized to be beneficial for relieving pain and inflammation. Although previous studies have reported anti-inflammatory effects of massage on skeletal muscles, the molecular mechanisms behind are poorly understood. We have recently developed a simple device to apply local cyclical compression (LCC), which can generate intramuscular pressure waves with varying amplitudes. Using this device, we have demonstrated that LCC modulates inflammatory responses of macrophages in situ and alleviates immobilization-induced muscle atrophy. Here, we describe protocols for the optimization and application of LCC as a massage-like intervention against immobilization-induced inflammation and atrophy of skeletal muscles of mouse hindlimbs. The protocol that we have developed can be useful for investigating the mechanism underlying beneficial effects of physical exercise and massage. Our experimental system provides a prototype of the analytical approach to elucidate the mechanical regulation of muscle homeostasis, although further development needs to be made for more comprehensive studies.

Here we describe the protocols for applying defined mechanical loads to mouse calves and for monitoring the concomitant intramuscular pressure changes. The experimental systems that we have developed can be useful for investigating the mechanism behind the beneficial effects of physical exercise and massage.

Application de perturbations de massage cohérentes sur les veaux de souris et surveillance des changements de pression intramusculaire qui en résultent

Massage is generally recognized to be beneficial for relieving pain and inflammation. Although previous studies have reported anti-inflammatory effects of ...

Functionalization of Atomic Force Microscope Cantilevers with Single-T Cells or Single-Particle for Immunological Single-Cell Force Spectroscopy

Atomic force microscopy based single cell force spectroscopy (AFM-SCFS) is a powerful tool for studying biophysical properties of living cells. This technique allows for probing interaction strengths and dynamics on a live cell membrane, including those between cells, receptor and ligands, and alongside many other variations. It also works as a mechanism to deliver a physical or biochemical stimulus on single cells in a spatiotemporally controlled manner, thus allowing specific cell activation and subsequent cellular events to be monitored in real-time when combined with live-cell fluorescence imaging. The key step in those AFM-SCFS measurements is AFM-cantilever functionalization, or in other words, attaching a subject of interest to the cantilever. Here, we present methods to modify AFM cantilevers with a single T cell and a single polystyrene bead respectively for immunological studies. The former involves a biocompatible glue that couples single T cells to the tip of a flat cantilever in a solution, while the latter relies on an epoxy glue for single bead adhesion in the air environment. Two immunological applications associated with each cantilever modification are provided as well. The methods described here can be easily adapted to different cell types and solid particles.

We present a protocol to functionalize atomic force microscope (AFM) cantilevers with a single T cell and bead particle for immunological studies. Procedures to probe single-pair T cell-dendritic cell binding by AFM and to monitor the real-time cellular response of macrophages to a single solid particle by AFM with fluorescence imaging are shown.

Fonctionnalisation des cantilevers de microscope de force atomique avec des cellules simples-T ou une seule particule pour la spectroscopie immunologique de force unicellulaire

Atomic force microscopy based single cell force spectroscopy (AFM-SCFS) is a powerful tool for studying biophysical properties of living cells. This ...