Le protocole fournit des cellules endothéliales à excroissance sanguine hautement prolifératives qui peuvent être utilisées pour diverses études d’ingénierie tissulaire, de thérapie cellulaire et de modélisation des maladies. Cette technique produit systématiquement de nombreuses cellules à partir d’une seule prise de sang. Pour que cette technique réussisse, il est crucial d’introduire rapidement les cellules dans le milieu de culture et l’environnement de l’incubateur dès que possible.
Tout d’abord, diluer la solution d’héparine à 100 unités par millilitre dans une solution saline stérile. Ajouter trois à quatre millilitres de solution d’héparine à chacun des deux tubes coniques de 50 millilitres et des deux seringues de 60 millilitres. Ensuite, aspirez 1 000 unités non diluées par millilitre de solution d’héparine dans un tube d’extension.
Connectez une aiguille de calibre 19 à une extrémité du tube d’extension rempli d’héparine et une seringue de 60 millilitres contenant de l’héparine à l’autre extrémité du tube d’extension. Ensuite, nettoyez la région fémorale de l’aine d’un porc anesthésié avec une solution de gommage à la bétadine. Percez la veine fémorale ou l’artère avec une aiguille de calibre 19 et à un à deux millilitres par seconde, aspirez lentement 50 millilitres de sang dans la seringue.
En laissant l’aiguille en place, pliez immédiatement le tube d’extension et débranchez la seringue de 60 millilitres. Transférer lentement le sang dans un tube conique de 50 millilitres contenant de l’héparine. Fermez hermétiquement le tube conique, inversez doucement le tube plusieurs fois pour mélanger et placez-le sur de la glace.
Connectez la seringue restante de 60 millilitres contenant de l’héparine au tube d’extension. Dépliez le tube d’extension et aspirez lentement 50 millilitres de sang supplémentaire dans la seringue. Retirez immédiatement l’aiguille de l’artère ou de la veine et aspirez lentement le sang restant du tube d’extension dans la seringue.
Débranchez la seringue de 60 millilitres du tube d’extension et transférez lentement le sang dans le tube conique de 50 millilitres contenant de l’héparine restante. Fermez hermétiquement le tube conique de 50 millilitres, retournez doucement plusieurs fois pour mélanger et placez-le sur la glace. Appliquez l’hémostase de pression sur la région fémorale de l’aine du porc.
Diluer le sang un à un avec du PBS dans quatre tubes coniques de 50 millilitres. Ajouter 25 millilitres de solution de gradient de densité prête à l’emploi à température ambiante à huit tubes coniques de 50 millilitres. Pipeter lentement 25 millilitres de solution saline sanguine à l’intérieur de chaque tube conique de 50 millilitres contenant une solution de gradient de densité en tenant le tube à un angle aigu par rapport à l’extrémité de la pipette.
Centrifuger les tubes pendant 30 minutes à 560 g et à température ambiante. Prélevez soigneusement la couche leucocytaire, qui est la couche trouble de cellules mononucléaires au-dessus de la solution à gradient de densité et sous le plasma clair, de chaque tube avec une pipette mince et répartissez-la uniformément dans deux nouveaux tubes coniques de 50 millilitres. Jeter la solution de gradient de densité contenant les tubes.
Pour enduire une plaque à six puits de fibronectine, préparez une solution mère de fibronectine plasmatique humaine en la diluant à un milligramme par millilitre dans de l’eau stérile. Faire 3,6 millilitres d’une solution de travail de fibronectine en diluant 600 microlitres de solution mère de fibronectine dans trois millilitres de PBS. Transférer 600 microlitres de la solution de travail à base de fibronectine dans chaque puits d’une plaque de six puits et rocher doucement jusqu’à ce qu’il soit uniformément enduit.
Et aspirez doucement la solution de chaque puits. Pour laver les cellules mononucléaires en attendant que la fibronectine soit enrobée, remplissez les tubes avec jusqu’à 45 millilitres de PBS, centrifugez pendant cinq minutes à 560 X g et quatre degrés Celsius avec une rupture basse. Aspirer le surnageant des deux tubes.
Remettez en suspension chaque pastille de cellule dans 25 millilitres de PBS. Remettez en suspension chaque pastille de cellule dans cinq millilitres de PBS et ajoutez 15 millilitres de solution de chlorure d’ammonium à 0,8% dans chaque tube. Lavez les cellules comme avant en ajoutant du PBS.
Aspirer le surnageant des deux tubes. Remettez en suspension chaque pastille de cellule dans 25 millilitres de PBS. Remettez chaque pastille cellulaire en suspension dans six millilitres de milieu de culture EGM-2 complété par 10% FBS et 1X solution antibiotique-antimycotique.
Transférer doucement deux millilitres de la suspension cellulaire dans chaque puits de la plaque à six puits recouverte de fibronectine et secouer doucement jusqu’à ce qu’elle soit uniformément recouverte. 24 heures après l’ensemencement des cellules, ajouter doucement un millilitre de milieu de culture frais à chaque puits. Le lendemain, aspirez doucement 1,5 millilitre de milieu de culture de chaque puits et remplacez-le par 1,5 millilitre de milieu de culture frais.
Pendant les cinq prochains jours, changez doucement le milieu de culture avec deux millilitres de milieu de culture frais par puits. Visualisez régulièrement les cultures cellulaires sous microscopie optique objective 4X de faible puissance. La morphologie des cellules cultivées a été observée depuis le début de la culture jusqu’à ce que les colonies BOEC soient observées.
Une plus petite population de cellules adhérentes a commencé à se fixer aux boîtes de culture et à se développer, tandis que les cellules non adhérentes ont été retirées avec des changements de milieu de culture. Les colonies sont apparues pour la première fois le sixième jour sous la forme d’une collection de cellules de type endothélial, proliférant radialement vers l’extérieur à partir d’un point central. Au fur et à mesure que la culture progressait, les colonies cellulaires devenaient plus denses et présentaient une morphologie pavée similaire à celle des cellules endothéliales matures.
La microscopie à contraste de phase bidimensionnel a été utilisée pour imager la formation de tubes dans un milieu sans sérum et un milieu de croissance complet. Les cellules des deux milieux ont subi une différenciation morphologique et se sont rapidement organisées en vastes réseaux de structures capillaires en forme de tube. Les BOEC ont en outre été caractérisés par l’expression du marqueur de cellules endothéliales matures CD31 ou de la molécule d’adhésion plaquettaire des cellules endothéliales un.
Les BOEC ont montré une expression uniforme de CD31. De plus, l’analyse par cytométrie en flux des BOEC avec anticorps CD14 AF 700 par rapport au groupe témoin positif a confirmé l’absence de CPE, car la cellule était colorée négativement pour le marqueur monocytaire CD14 par rapport au groupe témoin positif des PBMC. Coloration CD14 positive en bleu et cellules non colorées en rouge.
Lors de la collecte de sang, il est essentiel de recueillir autant de couche de pelage leucocytaire que possible tout en recueillant le moins possible des couches adjacentes. Cette technique a permis aux chercheurs d’étudier de nouvelles stratégies d’endothélialisation de dispositifs cardiovasculaires implantables à l’aide d’un modèle porcin avec des cellules endothéliales autologues à excroissance sanguine.
