Les dommages ischémiques induit un environnement pro-inflammatoire hostile affectant la survie des cellules transplantées. Notre protocole présente une méthode alternative pour fournir des produits biologiques en contournant la réponse immunitaire initiale aux dommages. Le principal avantage de ce protocole est qu’il permet d’administrer des thérapies une semaine après les blessures, imitant le traitement dans l’environnement clinique.
Notre objectif principal est sur le modèle de blessure de reperfusion d’ischémie et la transplantation des cellules STEM. Cependant, cette approche peut également être utilisée pour des modèles de maladies inflammatoires qui implique l’introduction de thérapies biologiques. Commencez par autoclaving tous les instruments chirurgicaux.
Si plusieurs interventions chirurgicales doivent être effectuées en une seule séance, nettoyez les instruments après chaque animal et stérilisez-les à l’aide d’un stérilisateur à perles chaudes. Administrer sous-cutanéement analgésique, peser l’animal, et entrer le poids dans le ventilateur. Raser le côté gauche de la poitrine du sternum au niveau de l’épaule et appliquer de la crème depilatory pour enlever l’excès de fourrure.
Pour éviter l’effondrement de poumon, maintenez la pression expiratoire de fin positive à deux centimètres d’eau pour la procédure de reperfusion d’ischémie et changez-la à trois centimètres d’eau pour l’injection retardée de la procédure de cellules. Après anesthésier la souris, l’intuber avec un tube entérachéal de calibre 20 et la transférer dans un coussin chauffant contrôlé pour maintenir une température corporelle de 35 à 37 degrés Celsius. Placez la souris dans la couchée latérale avec l’extrémité crânienne sur la gauche et l’extrémité caudale sur la droite.
Frotter la zone chirurgicale en alternant entre l’iode de povidone et les écouvillons d’alcool trois fois et appliquer l’onguent ophtalmique aux deux yeux. Utilisez un scalpel à lame numéro 10 pour faire une incision verticale de 2,5 millimètres à droite du mamelon le plus à gauche dans le champ de vision, puis utilisez des ciseaux pour couper à travers les couches musculaires superficielles jusqu’à ce que le muscle intercostal et les côtes soient visibles. Tout en soulevant les côtes et les tissus environnants, couper à travers l’espace intercostal entre les quatrième et cinquième côtes, puis insérer le rétracteur de paupières dans l’espace ouvert.
Rétractez le péricarde à l’aide de forceps incurvés, déplaçant le poumon vers le haut et hors de la vue. Passez une suture en nylon 9-0 à travers le myocarde sous l’artère LAD 2,5 millimètres distal à l’oreillette gauche maintenir un mouvement lisse et cohérent pour empêcher la déchirure du tissu ou de percer un vaisseau sanguin majeur. Attachez un nœud carré lâche, puis placez un centimètre de tube de polyéthylène dans le nœud lâche.
Fixer la suture autour du tube et confirmer l’ischémie par pâleur et arythmie ventriculaire, puis relâcher après 35 minutes. Après avoir enlevé le tube, attendre cinq minutes pour confirmer la re-perfusion du myocarde. Placez un tube de cathéter IV de calibre 24 dans la cavité thoracique d’un espace intercostal à droite de l’ouverture.
Utilisez des sutures absorbables 6-0 pour fermer l’incision intercostale dans un simple motif interrompu et la couche musculaire dans un modèle de suture continue. Après avoir fermé la couche musculaire superficielle, retirez le tube thoracique tout en retirant l’air de la cavité thoracique avec une seringue à tuberculine d’un millilitre. Fermez l’incision cutanée avec une suture absorbable 6-0 dans un motif de matelas horizontal continu.
Une fois terminé, administrer 1,5 millilitres de solution saline chaude sous-cutanée et appliquer une pommade antibiotique triple sur le site d’incision pour prévenir l’infection. Transférez la souris dans une cage sans literie ou une cage avec literie couverte sur un coussin chaud et une température de 35 à 37 degrés Celsius jusqu’à ce qu’elle soit complètement récupérée. Après avoir préparé et intubé la souris comme décrit précédemment, retirez la suture de la couche cutanée avec des ciseaux et des forceps, puis utilisez un scalpel numéro 10 pour faire une incision au même endroit que la chirurgie précédente.
Continuer à couper à travers le tissu cicatriciel jusqu’à ce que la suture de la couche musculaire est visible, puis utiliser les ciseaux et les forceps pour enlever la suture et couper la couche musculaire ouverte. Retirer les sutures tenant les côtes ensemble et continuer à couper à travers le muscle intercostal de l’incision précédente. Placez le rétracteur de paupières dans l’espace intercostal et localisez la zone de la ligature précédente.
Chargez 300 000 cellules SOUCHES mésenchymales suspendues dans 20 microlitres de PBS dans une seringue à insuline de calibre 30 et pliez légèrement l’aiguille pour atteindre l’angle approprié pour l’injection. Se déplaçant dans la direction de l’apex vers la base du cœur, insérez la seringue dans la région péri-infarctus jusqu’à ce que l’ouverture de l’aiguille soit complètement à l’intérieur du myocarde, puis injectez lentement les cellules dans le myocarde, attendez trois secondes et retirez l’aiguille. Observez le cœur de près pendant trois minutes pour vous assurer qu’il n’y a pas de réaction anormale aux cellules comme la fibrillation ventriculaire.
Après trois minutes, placez un tube de cathéter IV de calibre 24 dans la cavité thoracique d’un espace intercostal à droite de l’ouverture. Fermez les couches intercostales de muscle et de peau et enlevez le tube de coffre comme précédemment décrit. Administrer 1,5 millilitres de solution saline chaude sous-cutanée et appliquer une pommade antibiotique triple sur le site d’incision pour prévenir l’infection.
Transférez la souris dans une cage ou une cage sans literie avec literie couverte sur un coussin chaud jusqu’à ce qu’elle soit complètement récupérée. L’échocardiogramme postopératoire et l’électrocardiogramme ont été exécutés le jour suivant l’implantation de cellules STEM, confirmant l’infarctus et la fonction contractile ventriculaire diminuée. Un examen plus approfondi des données a montré que la fraction d’éjection et le raccourcissement fractionnel ont été diminués chez les souris qui ont reçu des dommages ischémiques, tandis que les volumes diastoliques et systoliques finaux ont augmenté.
La coloration trichrome de Masson du tissu myocardique sept jours après blessure a montré le dépôt accru de collagène et l’amincissement de la paroi ventriculaire gauche dans les coeurs des souris qui ont reçu des dommages ischémiques. La formation image bioluminescente in vivo ou BLI a été exécutée le jour après implantation mésenchymale de cellules souches. La livraison réussie des MSCs est illustrée par le signal de BLI comparé aux souris qui avaient induit des dommages de reperfusion d’ischémie mais n’ont pas reçu mscs.
Lorsque vous essayez ce protocole, gardez à l’esprit que les petits mouvements intentionnels lors de la coupe à travers les intercostals, ligating le navire, et les cellules d’injection sont essentiels pour prévenir les dommages indus au cœur ou le poumon dans le champ de vision. Ces procédures offrent la possibilité de surveiller la fonction cardiaque après la transplantation par ultrasons, la viabilité cellulaire par imagerie par bioluminescence, ou d’autres techniques moléculaires ou biochimiques selon la thérapie utilisée.
