Le travail a été soutenu par un financement de base du Conseil de recherches médicales. Nous sommes reconnaissants à Craig Nicol pour préparer des dessins techniques. Nous sommes reconnaissants à Matthew Pearson et Paul Perry pour leur soutien d&#39;imagerie.

Tous les travaux des animaux a été effectuée conformément aux directives institutionnelles sous licence par le Home Office du Royaume-Uni (numéro de licence du projet PPL 60/3785 et 60/4424). 1. Préparation <ol><li> Étiqueter les mélanoblastes dans la peau en développement en combinant une ligne appropriée recombinase Cre exprimant la souris avec une lignée de souris rapporteur fluorescent. Tyr :: CreA, Tyr :: CREB 8 et Wnt1 :: Cre 14 ont été utilisés avec succès comme lignes Cre-exprimant et R26YFPR 9 en tant que ligne de reporter. </li><li> Préparer le milieu de culture dans une hotte à flux laminaire; compléter milieu Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) avec (1% v / v de pénicilline / streptomycine), à ​​10% v / v de sérum de veau foetal et 0,584 g / L de L-glutamine. </li><li> Appareil d&#39;imagerie en temps réel est décrit sur ​​la figure 1 Stériliser la base de la chambre de formation d&#39;image par l&#39;essuyant avec 70% d&#39;éthanol. Stériliser les inserts, des clips d&#39;imagerie, et les joints toriques par trempage overnight dans 70% d&#39;éthanol. Utilisation d&#39;un couvercle stérile à partir d&#39;une plaque à 6 puits en tant que le couvercle de la chambre. </li><li> La surface inférieure de la chambre d&#39;imagerie est constitué d&#39;une membrane de lourdaud maintenu en place par un joint torique (Figure 1). Commencez avec un plat de lourdaud de 35 mm de gaz perméable. Placer le plat sur la chambre de l&#39;imagerie et de découper la membrane perméable au gaz avec une seule lame de rasoir tranchant. Pousser le joint torique au-dessus de la membrane pour le fixer à la chambre d&#39;imagerie. </li><li> Les clips d&#39;imagerie (6 au total) pince la peau embryonnaire en place (figure 1) avant de l&#39;utiliser, ils doivent être remplis avec 1% d&#39;agarose. Préparer une solution à 2% d&#39;agarose avec dH 2 O stérile par micro-ondes et le refroidissement à 60 ° C. Mix 1:1 avec 10 ml de milieu de culture (voir étape 2) préchauffé à 60 ° C. Placez les clips d&#39;imagerie 6 dans une plaque à 6 puits stérile. Goutte à goutte la solution d&#39;agarose à 1% dans le centre de chaque clip à l&#39;aide d&#39;une amende pastette et laisser refroidir. Ajouter 1 ml de PBS froid stérile à chaque puits pour empêcher l&#39;ungarose de se dessécher. Les séquences d&#39;imagerie peuvent être stockés pendant plusieurs heures dans du PBS. </li><li> Pour effectuer la séparation délicate de la peau embryonnaire et de manipuler le tissu disséqué utiliser la «méthode de bâton de cheveux&quot; comme décrit dans Kashiwagi et al. 3 Au lieu d&#39;utiliser une baguette une pique de brochette de bambou peut être utilisé. Faire une petite fente dans la partie plate de la brochette en utilisant une seule lame de rasoir tranchant et insérer une brosse à dents à poils doux. Couper la brochette de sorte qu&#39;il est d&#39;environ 15 cm de longueur. </li><li> Utiliser un microscope confocal avec une chambre environnementale complète ou organiser chambre supérieure offrant 5% de CO 2 dans l&#39;air. Préchauffer la platine du microscope à 37 ° C pendant au moins 1 heure avant l&#39;imagerie. Cela permet d&#39;éviter la dérive échantillon causée par la dilatation des composants de l&#39;étage comme ils se réchauffent. </li><li> Préparer un ensemble multi-position à l&#39;aide du logiciel de contrôle du microscope de sorte que l&#39;on peut rapidement et facilement centrer sur le milieu de chaque culture à mettre en place une expérimentationt. </li></ol> 2. Procédure <ol><li> Compagnon de la souris et désigner le premier jour après le coït comme 0,5 ME de jour. A E14.5 jour, abattre la femelle par dislocation cervicale et exposer la cavité du corps en faisant une petite incision médiane, écartant la peau vers la tête et la queue, puis couper le péritoine sous-jacent et peler dos de chaque côté du corps. Disséquer l&#39;utérus en froid PBS stérile en tenant fermement avec une pince et coupant le long de la mésomètre l&#39;aide de ciseaux chirurgicaux. Gardez l&#39;utérus sur la glace jusqu&#39;à ce que nécessaire. Pour une description détaillée, voir Shea et al. (2007) 15. </li><li> Disséquer les embryons de l&#39;utérus par la première coupe de la longueur de la paroi de l&#39;utérus avec des ciseaux chirurgicaux pour libérer la caduque et la dissection des embryons de la caduque par les séparant avec deux paires de pinces fines. Écran pour l&#39;expression de rapporteur fluorescent (si nécessaire). </li><li> Abattre embryons par décapitation avant la dissection. Subsenlever equently la queue et postérieurs membres, puis les pattes avant en utilisant une seule lame de rasoir tranchant. Conserver le tissu pour le génotypage si nécessaire. </li><li> Faire une incision dans la ventrale près de la ligne médiane dans une direction rostro-caudale. Utilisation des bâtons de cheveux décrites à l&#39;étape 1.6, à une distance de démêler soigneusement la peau à partir du tissu conjonctif sous-jacent l&#39;embryon tournant en même temps. Ne pas enlever la peau complètement, mais plutôt laisser attaché le long du bord le plus ventrale de la première incision. </li><li> Il est important de ne pas laisser la peau se foiré car il est alors très difficile à monter. Pour éviter cela, aplatir la peau en utilisant des bâtons de cheveux (côté cutanée de plus) sur la surface d&#39;une boîte de Pétri sec, puis couper le tronc de l&#39;embryon en utilisant une seule lame de rasoir tranchant. Le côté dermique peut être distinguée à partir du côté de l&#39;épiderme par une observation attentive de la jonction entre le tissu disséqué et l&#39;embryon avant la peau est enlevée. La surface du tissu disséqué estenviron 0,5 mm 2 en disséquant un embryon E14.5. </li><li> Placer un clip de formation d&#39;image sur le dessus de la peau de sorte que l&#39;agarose est en contact avec la face dermique du tissu. Laisser reposer pendant 60 secondes et ensuite soigneusement taquiner les bords du tissu sur les côtés de la pince. Inversez le clip et utiliser les cheveux colle à aplatir la peau et enlever les bulles d&#39;air, en prenant soin de toucher la surface du tissu (dans la zone qui sera imagée) aussi peu que possible. </li><li> Utilisez du fil de suture de soie pour lier la peau pour le clip d&#39;imagerie utilisant deux noeuds de pouce simples de chaque côté du clip d&#39;imagerie afin qu&#39;ils resserrent et tirer la peau dans la rainure près du sommet du clip. Inversez le clip, pousser à l&#39;intérieur de l&#39;insert d&#39;imagerie et le lieu de la base. Remplissez l&#39;insert avec ~ 5 ml de milieu de culture (voir l&#39;étape 1.2). Figure 1 présente l&#39;ensemble de la chambre de l&#39;imagerie. </li><li> Répétez protocole pour les 5 échantillons restants. </li></ol> 3. VivreImagerie <ol><li> La chambre d&#39;imagerie a les mêmes dimensions que la plaque à 6 puits standard. Utilisation d&#39;un insert de plaque approprié pour monter la chambre sur la platine du microscope confocal. </li><li> Une étape automatisée est nécessaire à l&#39;image des cultures en parallèle. Définir les six positions de l&#39;image dans le logiciel confocal. Les paramètres exacts dépendent de la capacité du microscope utilisé. Typiquement, une petite pile z (z 3-5 positions pour tenir compte de toute dérive de phase) est utilisé dans chacune des six positions et un z-pile est saisie toutes les 2 min pendant 18 à 24 h. Pour les applications live-imagerie, il est généralement avantageux d&#39;utiliser un cadre plus large que sténopé optique optimale pour réduire la puissance du laser et le nombre de z-sections requises. </li></ol>

<ol>
	<li>Thomas, A. J., Erickson, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+making+of+a+melanocyte:+the+specification+of+melanoblasts+from+the+neural+crest.">The making of a melanocyte: the specification of melanoblasts from the neural crest.</a> Pigment Cell &amp; Melanoma Research. 21 (6), 598-610 (2008).</li><li>Mayer, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+migratory+pathway+of+neural+crest+cells+into+the+skin+of+mouse+embryos.">The migratory pathway of neural crest cells into the skin of mouse embryos.</a> Developmental Biology. 34 (1), 39-46 (1973).</li><li>Kashiwagi, M., Huh, N., Turksen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ+Culture+of+Developing+Mouse+Skin+and+Its+Application+for+Molecular+Mechanistic+Studies+of+Morphogenesis.">Organ Culture of Developing Mouse Skin and Its Application for Molecular Mechanistic Studies of Morphogenesis.</a> Epidermal Cells: Methods and Protocols. 289, 39-45 (2005).</li><li>Kashiwagi, M., Kuroki, T., Huh, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+inhibition+of+hair+follicle+formation+by+epidermal+growth+factor+in+an+organ+culture+of+developing+mouse+skin.">Specific inhibition of hair follicle formation by epidermal growth factor in an organ culture of developing mouse skin.</a> Developmental Biology. 189 (1), 22-32 (1997).</li><li>Van Der Wel, L. I., Wei, L., Prens, E. P., Laman, J. D., Companjen, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modified+ex+vivo+skin+organ+culture+system+for+functional+studies.">A modified ex vivo skin organ culture system for functional studies.</a> Archives of Dermatological Research. 293 (4), 184-190 (2001).</li><li>Mort, R. L., Hay, L., Jackson, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+live+imaging+of+melanoblast+migration+in+embryonic+mouse+skin.">Ex vivo live imaging of melanoblast migration in embryonic mouse skin.</a> Pigment Cell &amp; Melanoma Research. 23 (2), 299-301 (2010).</li><li>Jordan, S. A. A., Jackson, I. J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MGF+(KIT+ligand)+is+a+chemokinetic+factor+for+melanoblast+migration+into+hair+follicles.">MGF (KIT ligand) is a chemokinetic factor for melanoblast migration into hair follicles.</a> Developmental Biology. 225 (2), 424-436 (2000).</li><li>Delmas, V., Martinozzi, S., Bourgeois, Y., Holzenberger, M., Larue, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cre-mediated+recombination+in+the+skin+melanocyte+lineage.">Cre-mediated recombination in the skin melanocyte lineage.</a> Genesis. 36 (2), 73-80 (2003).</li><li>Srinivas, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cre+reporter+strains+produced+by+targeted+insertion+of+EYFP+and+ECFP+into+the+ROSA26+locus.">Cre reporter strains produced by targeted insertion of EYFP and ECFP into the ROSA26 locus.</a> BMC Developmental Biology. 1 (1), (2001).</li><li>Li, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rac1+Drives+Melanoblast+Organization+during+Mouse+Development+by+Orchestrating+Pseudopod.">Rac1 Drives Melanoblast Organization during Mouse Development by Orchestrating Pseudopod.</a> Driven Motility and Cell-Cycle Progression. Developmental Cell. 21 (4), 722-734 (2011).</li><li>Li, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activated+Mutant+NRas(Q61K)+Drives+Aberrant+Melanocyte+Signaling,+Survival,+and+Invasiveness+via+a+Rac1-Dependent+Mechanism.">Activated Mutant NRas(Q61K) Drives Aberrant Melanocyte Signaling, Survival, and Invasiveness via a Rac1-Dependent Mechanism.</a> The Journal of Investigative Dermatology. , 1-12 (2012).</li><li>Schachtner, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+inducible+Lifeact+expression+allows+visualization+of+actin+dynamics+in+vivo+and+ex+vivo.">Tissue inducible Lifeact expression allows visualization of actin dynamics in vivo and ex vivo.</a> European Journal of Cell Biology. 91 (11-12), 923-929 (2012).</li><li>Ma, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fascin+1+is+transiently+expressed+in+mouse+melanoblasts+during+development+and+promotes+migration+and+proliferation.">Fascin 1 is transiently expressed in mouse melanoblasts during development and promotes migration and proliferation.</a> Development. 140 (10), 2203-2211 (2013).</li><li>Danielian, P. S., Muccino, D., Rowitch, D. H., Michael, S. K., McMahon, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modification+of+gene+activity+in+mouse+embryos+in+utero+by+a+tamoxifen-inducible+form+of+Cre+recombinase.">Modification of gene activity in mouse embryos in utero by a tamoxifen-inducible form of Cre recombinase.</a> Current Biology. 8 (24), 1323-1326 (1998).</li><li>Shea, K., Geijsen, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+6.5+dpc+mouse+embryos.">Dissection of 6.5 dpc mouse embryos.</a> Journal of Visualized Experiments. (2), (2007).</li></ol>

Les auteurs n&#39;ont rien à révéler.

Nous décrivons une méthode de culture embryonnaire peau qui est particularité prête à l&#39;imagerie des cellules vivantes sur des microscopes confocaux inversées. Le procédé comprend les améliorations récentes qui permettent 6 cultures à imager en parallèle et supprime le recours à matrigel et membranes Nuclepore de la méthode originale 6. La différence essentielle technique de techniques similaires est l&#39;utilisation d&#39;une membrane perméable aux gaz lourdaud pour établir une interfac...

Traditionnellement peau embryonnaire a été cultivée en disséquant de l&#39;embryon de souris et de montage sur une membrane en polycarbonate Nuclepore. La membrane est ensuite introduit sur ​​un milieu de culture, en maintenant ainsi une interface air-liquide sur la surface du tissu en développement 3,4. Cette technique a été utilisée pour analyser le comportement mélanoblaste en fixant le tissu et l&#39;évaluation de la distribution en utilisant mélanoblaste β-galactosidase en tant que marqueur 7. Nous avons développé une méthode qui permet mélanoblastes live-imagerie de fluorescence marqués en culture ex vivo de la peau 6. Ici, nous décrivons la méthode en détail de dissection, de configuration, de vivre l&#39;imagerie confocale et incluons certaines améliorations récentes. Mélanoblastes sont les précurseurs embryonnaires des mélanocytes, les cellules qui produisent le pigment dans les cheveux et la peau. Mélanoblastes se posent dans la crête neurale à côté du tube neural pendant la journée autour embryonnaire 9 (E9) chez la souris e développementmbryo. Par la suite, ils migrent le long d&#39;une voie dorsolatéral entre l&#39;ectoderme et les somites développement. A E12.5 ils se déplacent du derme à l&#39;épiderme où ils prolifèrent et continuent leur migration. Le motif de follicule pileux primaire commence à se former dans l&#39;épiderme à E14.5 et E15.5 par mélanoblastes sont à localiser ces follicules. Pour une analyse de l&#39;évolution mélanoblaste / mélanocytes voir Thomas &amp; Erickson (2008) 1. Afin de marquer la population mélanoblaste nous avons combiné Tyr :: CREB animaux qui expriment la Cre-recombinase dirigée par le promoteur de la tyrosinase de la souris avec 8 animaux R26YFPR qui expriment la protéine fluorescente jaune (YFP), conditionnellement à partir du locus ROSA26 9. Nous décrivons un procédé de culture d&#39;embryons images de la peau et de saisie à l&#39;aide d&#39;un microscope confocal inversé. Il est adapté sous forme de la méthode originale décrite dans Mort et al. (2010) 6. La présenteméthode permet l&#39;imagerie dans un format de 6 puits et élimine le recours à des membranes Nuclepore et sur matrigel à soutenir la culture. Au lieu de cela à l&#39;aide d&#39;un petit bloc d&#39;agarose à 1% pour stabiliser la peau embryonnaire. Retrait de la dépendance à l&#39;égard matrigel est particulièrement important dans les cas où la réponse de la peau embryonnaire à des facteurs de croissance solubles est l&#39;objet d&#39;étude. Notre méthode originale a déjà été utilisé pour acquérir de nouvelles connaissances dans le développement de mélanoblaste 10-13 et nous prévoyons que les améliorations que nous décrivons ici, il sera plus puissant qu&#39;une technique expérimentale en particulier lorsque plusieurs cultures parallèles sont une exigence.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="634">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMEM high glucose</td>
			<td style="width:132px;">Biochrom AG</td>
			<td style="width:119px;">F0475</td>
			<td style="width:167px;">without phenol red</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Penicillin</td>
			<td style="width:132px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P3032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Streptomycin</td>
			<td style="width:132px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">S9137</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Fetal calf serum</td>
			<td style="width:132px;">Hyclone</td>
			<td style="width:119px;">SV30160.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Glutamax</td>
			<td style="width:132px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">35050-038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ethanol</td>
			<td style="width:132px;">Generic</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Live imaging chamber</td>
			<td style="width:132px;">Custom made</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Lummox dishes</td>
			<td style="width:132px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:119px;">94.6077.410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">6-well plate</td>
			<td style="width:132px;">Greiner Bio-One</td>
			<td style="width:119px;">657-160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Single edged razor blade</td>
			<td style="width:132px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">1244-3170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Agarose</td>
			<td style="width:132px;">Biogene</td>
			<td style="width:119px;">300-300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Fine pastette</td>
			<td style="width:132px;">Generic</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PBS</td>
			<td style="width:132px;">Generic</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Kebab skewers</td>
			<td style="width:132px;">Waitrose</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Bamboo BBQ skewers 30cm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Toothbrush</td>
			<td style="width:132px;">Generic</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Petri dishes</td>
			<td style="width:132px;">Greiner Bio-One</td>
			<td style="width:119px;">633185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Suture thread</td>
			<td style="width:132px;">Look</td>
			<td style="width:119px;">SP115</td>
			<td>Black silk suture thread</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ex vivo culture of mouse embryonic skin and live-imaging of melanoblast migration

Mélanoblastes sont la crête neurale précurseurs de mélanocytes dérivés; les cellules responsables de la production du pigment dans la peau et les cheveux. Mélanoblastes migrent à travers l&#39;épiderme de l&#39;embryon où elles colonisent ensuite le développement de follicules de cheveux de 1,2. La migration des cellules de la crête neurale est largement étudiée in vitro, mais les méthodes in vivo ne sont pas encore bien développée, surtout dans les systèmes mammifères. Une alternative est d&#39;utiliser culture ex vivo organotypique 3-6. Culture de peau embryonnaire de la souris nécessite le maintien d&#39;une interface air-liquide (ALI) à travers la surface du tissu de 3,6. Haute résolution live-imagerie de la peau embryonnaire de la souris a été entravée par l&#39;absence d&#39;une bonne méthode qui maintient non seulement ce ALI mais permet aussi la culture à être inversée et donc compatible avec courte distance de travail lentilles de l&#39;objectif et des microscopes les plus confocale. Cet article décrit les améliorations récentes à une méthod qui utilise une membrane perméable aux gaz pour surmonter ces problèmes et de permettre à haute résolution de l&#39;imagerie confocale peau embryonnaire en culture ex vivo 6. En utilisant un mélanoblaste Cre recombinase spécifique exprimant lignée de souris combinée avec la ligne de reporter R26YFPR nous sommes en mesure de marquer par fluorescence la population mélanoblaste dans ces cultures de la peau. Cette technique permet de live-imagerie de mélanoblastes et l&#39;observation de leur comportement et les interactions avec le tissu dans lequel elles se développent. Les résultats représentatifs sont inclus pour démontrer la capacité de vivre-image 6 cultures en parallèle.

La figure 2 montre des résultats représentatifs d&#39;une expérience de laps de temps à l&#39;aide de la peau embryonnaire de Tyr :: CREB x embryons R26YFPR à E14.5. 6 cultures embryonnaires de la peau ont été imagées par microscopie confocale toutes les 2 min pendant 18 heures. Le progiciel d&#39;analyse d&#39;image ImageJ freeware a été utilisé pour analyser le comportement des mélanoblastes YFP marqués dans les 6 films. Les mélanoblastes étaient détectés automatique...

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Ex vivo Culture of Mouse Embryonic Skin and Live-imaging of Melanoblast Migration

Nous décrivons la dissection et la culture ex vivo de peau embryonnaire de la souris. Le système de culture maintient une interface air-liquide sur la surface du tissu et permet une imagerie sur un microscope inversé. Mélanoblastes, une composante de la peau en développement, sont marqué par fluorescence permettant leur comportement à observer par microscopie confocale.

Ex vivo Culture de la peau de souris embryonnaires et Live-imagerie de la migration mélanoblaste

Melanoblasts are the neural crest derived precursors of melanocytes; the cells responsible for producing the pigment in skin and hair. Melanoblasts ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Ex vivo Culture of Mouse Embryonic Skin and Live-imaging of Melanoblast Migration

12.5K vues.  University of Edinburgh.  Nous décrivons la dissection et la culture ex vivo de peau embryonnaire de la souris. Le système de culture maintient une interface air-liquide sur la surface du tissu et permet une imagerie sur un microscope inversé. Mélanoblastes, une composante de la peau en développement, sont marqué par fluorescence permettant leur comportement à observer par microscopie confocale. 

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Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo (New Culture)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  the formation and patterning of brain, neural tube, somite and heart primordia. Applications of chick embryo culture include electroporation of DNA or RNA constructs in order to analyze gene function, grafts of growth factor coated beads such as FGFs and BMPs , as well as whole mount in situ hybridization and immunohistochemistry. This video demonstrates the different steps in chick embryo culture; First, the embryo is explanted in saline. Then, the embryo is centered on a glass ring. The membranes surrounding the embryo are lifted along the walls of the ring. The ring is then placed in a culture dish containing a pool of albumine. The culture dish is sealed and placed in a humid chamber, where the embryo is cultured for up to 24 hrs. Finally, the embryo is removed from the ring, fixed and processed for further applications. A troubleshooting guide is also presented.

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo New Culture

This video demonstrates New culture, a method by which chick embryos are cultured outside the egg for up to 24 hr. This method enables one to study early development (primitive streak to 14 som.), a period corresponding to E7-9 in mouse. Applications of this technique include electroporation, in situ hybridization and immunohistochemistry.

Méthode pour la culture d&#39;embryons de poulet Early ex vivo (Nouvelle Culture)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

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Biologie

Live Imaging of Glial Cell Migration in the Drosophila Eye Imaginal Disc

Glial cells of both vertebrate and invertebrate organisms must migrate to final target regions in order to ensheath and support associated neurons. While recent progress has been made to describe the live migration of glial cells in the developing pupal wing (1), studies of Drosophila glial cell migration have typically involved the examination of fixed tissue. Live microscopic analysis of motile cells offers the ability to examine cellular behavior throughout the migratory process, including determining the rate of and changes in direction of growth. Paired with use of genetic tools, live imaging can be used to determine more precise roles for specific genes in the process of development. Previous work by Silies et al. (2) has described the migration of glia originating from the optic stalk, a structure that connects the developing eye and brain, into the eye imaginal disc in fixed tissue. Here we outline a protocol for examining the live migration of glial cells into the Drosophila eye imaginal disc. We take advantage of a Drosophila line that expresses GFP in developing glia to follow glial cell progression in wild type and in mutant animals.

Here we describe a protocol to examine the migration of glial cells into the developing Drosophila eye using live microscopic analysis paired with GFP tagged glial cells.

Imagerie de la migration en direct des cellules gliales dans le disque Eye drosophile Imaginal

Glial cells of both vertebrate and invertebrate organisms must migrate to final target regions in order to ensheath and support associated neurons.  While ...

Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the developing zebrafish brain (Gutzman et al, 2008). Such analysis affords a new understanding of the underlying cell biology required for development of the 3D structure of the vertebrate brain, and significantly increases our ability to study neural tube morphogenesis. The embryonic zebrafish brain is shaped beginning at 18 hours post fertilization (hpf) as the ventricles within the neuroepithelium inflate. By 24 hpf, the initial steps of neural tube morphogenesis are complete. Using the method described here, embryos at the one cell stage are injected with mRNA encoding membrane-targeted green fluorescent protein (memGFP). After injection and incubation, the embryo, now between 18 and 24 hpf, is mounted, inverted, in agarose and imaged by confocal microscopy. Notably, the zebrafish embryo is transparent making it an ideal system for fluorescent imaging. While our analyses have focused on the midbrain-hindbrain boundary and the hindbrain, this method could be extended for analysis of any region in the zebrafish to a depth of 
80-100 &mu;m.

In this video, we demonstrate a method by which to analyze the developing vertebrate brain in live zebrafish embryos at single cell resolution by confocal microscopy. This includes the method by which we inject the single-cell zebrafish embryo and subsequently mount and image the developing brain.

En direct l&#39;imagerie du cerveau de poisson zèbre embryonnaires par microscopie confocale

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the ...

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we present a protocol for the mounting of Drosophila melanogaster embryos and subsequent live imaging of fluorescently labeled hemocytes, the embryonic macrophages of this organism. Using the Gal4-uas system1 we drive the expression of a variety of genetically encoded, fluorescently tagged markers in hemocytes to follow their developmental dispersal throughout the embryo. Following collection of embryos at the desired stage of development, the outer chorion is removed and the embryos are then mounted in halocarbon oil between a hydrophobic, gas-permeable membrane and a glass coverslip for live imaging. In addition to gross migratory parameters such as speed and directionality, higher resolution imaging coupled with the use of fluorescent reporters of F-actin and microtubules can provide more detailed information concerning the dynamics of these cytoskeletal components.

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Drosophila hemocytes disperse over the entirety of the developing embryo. This protocol demonstrates how to mount and image these migrations using embryos with fluorescently labelled hemocytes.

En direct de l&#39;imagerie Drosophila melanogaster Migrations hémocytaires embryonnaires

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we ...

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models. This paper describes the development of an orthotopic mouse model of ovarian cancer, treatment of cancer via oral delivery of drugs, and monitoring of tumor cell behavior in response to drug treatment in real time using in vivo imaging system. In this orthotopic model, ovarian tumor cells expressing luciferase are applied topically by injecting them directly into the mouse bursa where each ovary is enclosed. Upon injection of D-luciferin, a substrate of firefly luciferase, luciferase-expressing cells generate bioluminescence signals. This signal is detected by the in vivo imaging system and allows for a non-invasive means of monitoring tumor growth, distribution, and regression in individual animals. Drug administration via oral gavage allows for a maximum dosing volume of 10 mL/kg body weight to be delivered directly to the stomach and closely resembles delivery of drugs in clinical treatments. Therefore, techniques described here, development of an orthotopic mouse model of ovarian cancer, oral delivery of drugs, and in vivo imaging, are useful for better understanding of human ovarian cancer and treatment and will improve targeting this disease.

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Orthotopic animal models of ovarian cancer replicate better human disease and therefore enhance our understanding of cancer progression and tumor response to therapy. A mouse model receives an intrabursal injection of luciferase-expressing ovarian tumor cells. Treatment is administered via oral gavage. Tumor growth is monitored by in vivo imaging system.

L&#39;imagerie in vivo et des traitements thérapeutiques dans un modèle de souris orthotopique de cancer des ovaires

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models.  This paper describes the development of an orthotopic mouse model ...

Ex Vivo Culture of Primary Human Fallopian Tube Epithelial Cells

Epithelial ovarian cancer is a leading cause of female cancer mortality in the United States. In contrast to other women-specific cancers, like breast and uterine carcinomas, where death rates have fallen in recent years, ovarian cancer cure rates have remained relatively unchanged over the past two decades 1. This is largely due to the lack of appropriate screening tools for detection of early stage disease where surgery and chemotherapy are most effective 2, 3. As a result, most patients present with advanced stage disease and diffuse abdominal involvement. This is further complicated by the fact that ovarian cancer is a heterogeneous disease with multiple histologic subtypes 4, 5. Serous ovarian carcinoma (SOC) is the most common and aggressive subtype and the form most often associated with mutations in the BRCA genes. Current experimental models in this field involve the use of cancer cell lines and mouse models to better understand the initiating genetic events and pathogenesis of disease 6, 7. Recently, the fallopian tube has emerged as a novel site for the origin of SOC, with the fallopian tube (FT) secretory epithelial cell (FTSEC) as the proposed cell of origin 8, 9. There are currently no cell lines or culture systems available to study the FT epithelium or the FTSEC. Here we describe a novel ex vivo culture system where primary human FT epithelial cells are cultured in a manner that preserves their architecture, polarity, immunophenotype, and response to physiologic and genotoxic stressors. This ex vivo model provides a useful tool for the study of SOC, allowing a better understanding of how tumors can arise from this tissue, and the mechanisms involved in tumor initiation and progression.

Ex Vivo Culture of Primary Human Fallopian Tube Epithelial Cells

The fallopian tube (FT) is emerging as an alternative site of origin for serous ovarian carcinoma (SOC). This protocol describes a novel method for the isolation and ex vivo culture of fallopian tube epithelial cells. This system recapitulates the in vivo epithelium and allows the study of SOC pathogenesis.

Culture ex vivo des cellules humaines primaires épithéliales des trompes de Fallope

Epithelial ovarian cancer is a leading cause of female cancer mortality in the United States. In contrast to other women-specific cancers, like breast and ...

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

The pancreas controls vital functions of our body, including the production of digestive enzymes and regulation of blood sugar levels1. Although in the past decade many studies have contributed to a solid foundation for understanding pancreatic organogenesis, important gaps persist in our knowledge of early pancreas formation2. A complete understanding of these early events will provide insight into the development of this organ, but also into incurable diseases that target the pancreas, such as diabetes or pancreatic cancer. Finally, this information will generate a blueprint for developing cell-replacement therapies in the context of diabetes.
 During embryogenesis, the pancreas originates from distinct embryonic outgrowths of the dorsal and ventral foregut endoderm at embryonic day (E) 9.5 in the mouse embryo3,4. Both outgrowths evaginate into the surrounding mesenchyme as solid epithelial buds, which undergo proliferation, branching and differentiation to generate a fully mature organ2,5,6. Recent evidences have suggested that growth and differentiation of pancreatic cell lineages, including the insulin-producing &beta;-cells, depends on proper tissue-architecture, epithelial remodeling and cell positioning within the branching pancreatic epithelium7,8. However, how branching morphogenesis occurs and is coordinated with proliferation and differentiation in the pancreas is largely unknown. This is in part due to the fact that current knowledge about these developmental processes has relied almost exclusively on analysis of fixed specimens, while morphogenetic events are highly dynamic.
 Here, we report a method for dissecting and culturing mouse embryonic pancreatic buds ex vivo on glass bottom dishes, which allow direct visualization of the developing pancreas (Figure 1). This culture system is ideally devised for confocal laser scanning microscopy and, in particular, live-cell imaging. Pancreatic explants can be prepared not only from wild-type mouse embryos, but also from genetically engineered mouse strains (e.g. transgenic or knockout), allowing real-time studies of mutant phenotypes. Moreover, this ex vivo culture system is valuable to study the effects of chemical compounds on pancreatic development, enabling to obtain quantitative data about proliferation and growth, elongation, branching, tubulogenesis and differentiation. In conclusion, the development of an ex vivo pancreatic explant culture method combined with high-resolution imaging provides a strong platform for observing morphogenetic and differentiation events as they occur within the developing mouse embryo.

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

Here, we describe a method for isolation, culture and manipulation of mouse embryonic pancreas. This represents an excellent ex vivo system for studying various aspects of pancreatic development, including morphogenesis, differentiation and growth. Pancreatic bud explants can be cultured for several days and used in a range of different applications, including whole-mount immunofluorescence and live imaging.

Un système d&#39;<em&gt; Ex vivo</emLa culture&gt; de pancréas embryonnaire

The pancreas controls vital functions of our body,  including the production of digestive enzymes and regulation of blood sugar  levels1. Although in the ...

A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse Heart

Developmental studies in the mouse are hampered by the inaccessibility of the embryo during gestation. Thus, protocols to isolate and culture individual organs of interest are essential to provide a method of both visualizing changes in development and allowing novel treatment strategies. To promote the long-term culture of the embryonic heart at late stages of gestation, we developed a protocol in which the excised heart is cultured in a semi-solid, dilute Matrigel. This substrate provides enough support to maintain the three-dimensional structure but is flexible enough to allow continued contraction. In brief, hearts are excised from the embryo and placed in a mixture of cold Matrigel diluted 1:1 with growth medium. After the diluted Matrigel solidifies, growth medium is added to the culture dish. Hearts excised as late as embryonic day 16.5 were viable for four days post-dissection. Analysis of the coronary plexus shows that this method does not disrupt coronary vascular development. Thus, we present a novel method for long-term culture of embryonic hearts.

A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse Heart

Developmental studies in the mouse are hampered by the inaccessibility of the embryo during gestation. To promote the long-term culture of the embryonic heart at late stages of gestation, we developed a protocol in which the excised heart is cultured in a semi-solid, dilute Matrigel.

A Novel<em&gt; Ex vivo</em&gt; Méthode de la culture pour le embryonnaire Souris Coeur

Developmental studies in the mouse are hampered  by the inaccessibility of the embryo during gestation. Thus, protocols to  isolate and culture individual ...

Mouse Fetal Whole Intestine Culture System for Ex Vivo Manipulation of Signaling Pathways and Three-dimensional Live Imaging of Villus Development

Most morphogenetic processes in the fetal intestine have been inferred from thin sections of fixed tissues, providing snapshots of changes over developmental stages. Three-dimensional information from thin serial sections can be challenging to interpret because of the difficulty of reconstructing serial sections perfectly and maintaining proper orientation of the tissue over serial sections. Recent findings by Grosse et al., 2011 highlight the importance of three- dimensional information in understanding morphogenesis of the developing villi of the intestine1. Three-dimensional reconstruction of singly labeled intestinal cells demonstrated that the majority of the intestinal epithelial cells contact both the apical and basal surfaces. Furthermore, three-dimensional reconstruction of the actin cytoskeleton at the apical surface of the epithelium demonstrated that the intestinal lumen is continuous and that secondary lumens are an artifact of sectioning. Those two points, along with the demonstration of interkinetic nuclear migration in the intestinal epithelium, defined the developing intestinal epithelium as a pseudostratified epithelium and not stratified as previously thought1. The ability to observe the epithelium three-dimensionally was seminal to demonstrating this point and redefining epithelial morphogenesis in the fetal intestine. With the evolution of multi-photon imaging technology and three-dimensional reconstruction software, the ability to visualize intact, developing organs is rapidly improving. Two-photon excitation allows less damaging penetration deeper into tissues with high resolution. Two-photon imaging and 3D reconstruction of the whole fetal mouse intestines in Walton et al., 2012 helped to define the pattern of villus outgrowth2. Here we describe a whole organ culture system that allows ex vivo development of villi and extensions of that culture system to allow the intestines to be three-dimensionally imaged during their development.

Mouse Fetal Whole Intestine Culture System for Ex Vivo Manipulation of Signaling Pathways and Three-dimensional Live Imaging of Villus Development

Improved imaging technology is allowing three-dimensional imaging of organs during development. Here we describe a whole organ culture system that allows live imaging of the developing villi in the fetal mouse intestine.

Souris foetal entier Intestin Système de culture pour<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Manipulation des voies de signalisation et d&#39;imagerie en direct en trois dimensions du développement des villosités

Most morphogenetic processes in the fetal intestine have been inferred from thin sections of fixed tissues, providing snapshots of changes over ...

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a versatile analytical tool for characterizing viscoelastic mechanical properties for a variety of materials ranging from hard (plastic, glass, metal, etc.) surfaces to cells on any substrate. It has been widely used to measure the stiffness of cells, but less frequently used to measure the stiffness of aortas. In this paper, we will describe the procedures for using AFM in contact mode to measure the ex vivo elastic modulus of unloaded mouse arteries. We describe our procedure for isolation of mouse aortas, and then provide detailed information for the AFM analysis. This includes step-by-step instructions for alignment of the laser beam, calibration of the spring constant and deflection sensitivity of the AFM probe, and acquisition of force curves. We also provide a detailed protocol for data analysis of the force curves.

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

We present detailed protocols for isolation of aortas from mouse and measurement of their elastic modulus using atomic force microscopy.

Mesure de la rigidité de<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Souris aortes Utiliser Atomic Force Microscopy

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a ...