Cette méthode décrit une technique permettant d’étudier le remodelage membranaire pendant la migration des neutrophiles chez l’animal vivant à l’aide de la microscopie subcellulaire intravitale. Ce protocole offre une approche unique pour étudier la dynamique membranaire pendant la migration animale dans des conditions physiques, et pour ne pas impliquer le microenvironnement tissulaire. Cette technique peut être adaptée pour traiter le remodelage membranaire et le cytosquelette, le repositionnement dynamique des organes et le trafic membranaire dans différents types de cellules et de cellules migratrices.
Pour commencer, ajoutez le colorant fluorescent vert à la suspension de neutrophiles, purifié de la souris de type sauvage dans 1,5 millilitre de tube recouvert de BSA. Incuber pendant 30 minutes à température ambiante sous une légère agitation dans un rotateur de tube. Effectuez trois lavages à l’aide de HBSS, suivis d’une centrifugation à 400 fois G à température ambiante pendant cinq minutes, et de la remise en suspension de la pastille dans une solution saline équilibrée Hanks d’un millilitre.
Placez cette suspension dans le tube revêtu de BSA dans un rotateur de tube sous une légère agitation jusqu’à la procédure d’injection. Avant l’injection, remettre en suspension la pastille cellulaire dans une solution saline pour atteindre une densité de 2 à 5 millions de cellules par 20 microlitres. Transférez l’animal anesthésié dans un coussin chauffant à 37 degrés Celsius pour maintenir sa température corporelle.
Après avoir testé le réflexe de retrait de la patte, retirez les poils de l’oreille à l’aide d’une tondeuse fine pour optimiser la qualité de l’image. Placez l’animal sur le côté, tenez le bord de l’oreille et aplatissez-le le long du coussin chauffant à l’aide du ruban chirurgical, puis remplissez une seringue équipée d’une aiguille de calibre 33 avec la suspension des neutrophiles et montez-la sur un micromanipulateur. Déplacez doucement l’aiguille vers l’oreille et percez lentement la peau.
Une fois que l’aiguille est à l’intérieur de la peau, poussez lentement le piston et délivrez deux à trois microlitres de suspension cellulaire. Après avoir soigneusement répété l’injection pour deux à trois zones différentes de l’oreille, retirez soigneusement le ruban chirurgical et laissez l’animal reprendre conscience sous surveillance. Laissez l’animal se reposer pendant une heure avant l’imagerie pour permettre aux tissus et aux cellules de se remettre de la procédure d’injection.
Assurez-vous que le microscope est allumé et que la platine et les lentilles sont préchauffées à 37 degrés Celsius avant de placer l’animal anesthésié sur la platine du microscope. Couvrez le trou dans la scène avec une lamelle en verre. Déplacez l’animal anesthésié sur la scène avec précaution.
Si l’imagerie est prévue pendant plus d’une heure, appliquez la pommade ophtalmique et fixez le système de perfusion à perfusion ailée. Placez une goutte de solution saline au centre de la lamelle et placez l’oreille injectée de neutrophiles par-dessus. Aplatissez doucement l’oreille à l’aide d’un coton-tige stérile au centre de la lamelle pour éliminer les poches d’air.
Fixez l’oreille en appuyant doucement un bâton en bois sur le côté de l’oreille plus près de la tête de l’animal et en le verrouillant à l’aide de ruban adhésif. Trouvez ensuite une zone d’intérêt à l’aide de l’oculaire du microscope et passez en mode d’acquisition multiphotonique. Réglez la longueur d’onde d’excitation laser sur 900 à 930 nanomètres pour permettre l’acquisition simultanée de colorant fluorescent vert, de mTomato et de collagène-I.
Réglez ensuite l’ensemble approprié de miroirs et de combinaisons de filtres sur les détecteurs pour collecter la lumière émise. Déterminez le paramètre le plus approprié à la configuration matérielle. Même si les cellules en migration peuvent être suivies avec des intervalles de 30 secondes à une minute, imagez les événements subcellulaires avec une vitesse plus élevée, d’au moins moins moins dix secondes d’intervalle.
Dans l’approche classique de la microscopie intravitale, utilisez un objectif 30X et un scanner Galvo d’une taille d’image de 512 par 512 pixels pour suivre la migration cellulaire et étudier le tissu de la souris hôte, et réglez le déplacement de l’axe Z à l’aide de la platine motorisée avec une taille de pas de deux micromètres pour permettre l’imagerie d’un volume de 30 micromètres de profondeur toutes les 30 secondes. Dans l’approche de microscopie subcellulaire intravitale, utilisez une lentille 40X et un scanner de résonance avec une moyenne de trois fois pour imager le remodelage membranaire hautement dynamique à un grossissement et une résolution plus élevés. Réglez également le déplacement de l’axe Z à l’aide d’un piézo d’une taille de pas d’un micromètre, permettant une imagerie de volume profond de 20 micromètres toutes les quatre à cinq secondes.
Induire une lésion laser stérile pour déclencher la migration des neutrophiles en focalisant un laser d’excitation de haute puissance sur une zone étroite de 20 par 20 micromètres pendant 10 secondes. Identifiez les lésions induites par le laser par ses puissants signaux autofluorescents apparaissant dans tous les canaux, et par l’altération de l’arrangement du collagène qui en résulte. Enregistrez les données à la fin de l’expérimentation pour des analyses plus approfondies.
La souris réceptrice a permis de visualiser les caractéristiques structurelles du tissu de l’oreille telles que les vaisseaux sanguins, les cellules résidentes et les follicules pileux via une approche basée sur la microscopie intravitale. Les lésions induites par le laser ont été facilement visualisées en raison de leur forte autofluorescence détectée dans tous les canaux, et par les altérations de l’arrangement du collagène. Une vue complète de l’architecture tridimensionnelle de la peau et de la localisation des neutrophiles injectés représente un empilement Z de la peau des couches externe aux couches internes dans un rendu volumique tridimensionnel.
L’imagerie en accéléré a montré que les neutrophiles échantillonnaient la peau de l’oreille et interagissaient avec la matrice intracellulaire et le tissu hôte. À l’aide de la microscopie subcellulaire intravitale, le remodelage dynamique de la membrane plasmique pendant la migration, la formation de saillies membranaires sur le bord d’attaque et la rétraction de l’arrière des cellules sont clairement visualisés. Les séquences time-lapse révèlent la complexité des interactions avec la matrice intracellulaire.
La dynamique locale de la membrane plasmique a été analysée à l’aide d’un pipeline algorithmique basé sur l’identification de 100 points limites sous-jacents à la surface de la cellule. Les changements dans la courbure locale et la zone soulignée par les saillies de la membrane plasmique ont été calculés pour chaque point limite et rapportés pour chaque période sous forme de kymographes. L’avant et l’arrière des cellules conservent une courbure plus élevée que le côté des cellules.
Les changements de zone négatifs sont plus apparents à l’arrière des cellules qu’au bord d’attaque, où les changements de zone positifs sont plus proéminents. Après l’imagerie, les tissus peuvent être collectés, fixés et traités pour la coloration afin d’évaluer davantage la cible d’intérêt et d’élucider les mécanismes. Cette procédure, conçue pour imager la dynamique membranaire, peut être adaptée pour répondre à des questions plus larges de biologie cellulaire dans différents types de cellules et de cellules migrantes dans leurs environnements respectifs.
