Analyse de l'intégrité de la barrière hémato-encéphalique dans le mélanogaster Drosophila

Cette méthode peut aider à répondre aux questions clés concernant la régulation génétique de la formation et le maintien de la barrière céphalo-encéphalique au cours de plusieurs étapes du développement de la drosophile. Cette méthode peut également être adaptée pour examiner la perméabilité d’autres barrières, comme l’épithélium intestinal dans une variété d’organismes. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet l’évaluation de la fonction de barrière céphalo-encéphalique dans les tissus vivants.

La démonstration visuelle de cette méthode est critique, car les manipulations d’échantillon peuvent être difficiles et beaucoup d’étapes exigent une attention particulière aux détails. Pour la collecte d’embryons placer un minimum de 50 femelles vierges avec 20 à 25 mâles par bouteille avec corn meal agar nourriture et incuber ces mouches pendant un à deux jours avant de commencer les collections. La veille de la collecte, les assiettes chaudes d’agar de jus de pomme à 25 degrés Celsius pendant la nuit.

Le lendemain matin, transférez les mouches anesthésiées au dioxyde de carbone dans une cage de collecte et placez une assiette d’agar de jus de pomme préchauffée avec un petit frottis de pâte de levure à l’extrémité ouverte de la cage. Ensuite, fixez la plaque à la cage avec la manche rouge. Pour effacer les embryons plus âgés, laissez les mouches pondre des œufs sur une plaque d’agar de jus de pomme pendant une heure à 25 degrés Celsius.

À la fin de l’incubation, inverser le côté maille de la cage vers le bas et appuyez sur les mouches au fond de la cage. Remplacez la sagar au jus de pomme par une nouvelle assiette d’agar préchauffée au jus de pomme par un petit frottis de pâte de levure. Laissez les mouches pondre des œufs sur la nouvelle plaque pendant une heure à 25 degrés Celsius.

Pour recueillir les embryons de stade avancé 17 pour injection, remplacez la plaque d’agar de jus de pomme par une nouvelle plaque préchauffée par un frottis de pâte de levure. Et permettre aux mouches de pondre des œufs dans l’assiette à 25 degrés Celsius. Au bout d’une heure, remplacer la plaque et vieillir la plaque par des embryons recueillis pendant 19 heures à 25 degrés Celsius afin que les embryons soient âgés de 20 à 21 heures au moment de l’imagerie.

À la fin de l’incubation de 19 heures, retirer la plaque de collecte d’embryons de l’incubateur et couvrir la surface de la plaque avec PbTx. Utilisez un pinceau pour desserrer les embryons de la surface de la plaque dans une passoire en maille de nylon de 70 micromètres. Et placez la passoire avec des embryons dans une solution d’eau de Javel à 50% dans une boîte de Pétri de 100 millimètres pendant cinq minutes avec agitation occasionnelle à température ambiante pour les déchorionner.

À la fin de l’incubation, rincer les embryons trois fois en faisant tourbillonnant la passoire dans du PbTx frais, à l’aide d’une nouvelle boîte de Pétri pour chaque lavage. Laver les embryons d’un côté de la passoire avec PbTx et utiliser une pipette en verre pour transférer les embryons sur une dalle de gel agarose de 2 %. Retirer l’excédent de liquide avec du papier filtre.

Alignez six à huit embryons sur la dalle avec les postérieures à droite et les côtés dorsaux orientés vers le haut et appuyez fermement sur un morceau de ruban adhésif à double face apposé sur une diapositive sur le dessus des embryons. Ensuite, dessiccate les embryons à température ambiante pendant environ 25 minutes avant de couvrir les spécimens avec de l’huile d’halocarbone. Pour la collecte larvaire, installez une croix avec 5 à 10 mouches femelles vierges du génotype désiré et deux fois moins de mâles du génotype désiré dans un flacon avec de la nourriture de gélose de maïs.

Après cinq à sept jours à 25 degrés Celsius, selon le génotype, utilisez des forceps pour recueillir délicatement les larves errantes du troisième stade du flacon et rincer les larves avec du PBS pour enlever les aliments collés. Transférer les larves dans une plaque d’agar de jus de pomme pour le génotypage au besoin avant d’utiliser un pinceau pour sécher les larves sur un tissu. Utilisez ensuite des forceps pour transférer six à huit larves sur une lame préparée avec du ruban adhésif à double face.

Avant l’injection, utilisez un puller micropipette pour tirer les tubes capillaires dans une forme d’aiguille standard pour les injections de D.Melanogaster et ancrer les aiguilles dans de l’argile dans une boîte de Pétri. Pour l’injection d’embryons, utilisez une pointe de pipette de chargement de gel de 20 microlitres pour charger une aiguille préparée de 5 microlitres de 10 kilodalton dextran conjugués au chlorure acide sulforhodamine 101 et charger l’aiguille dans un porte-aiguille. Placez l’aiguille dans un micromanipulateur fixé à une base en acier et réglez l’appareil d’injection à 50 livres par pouce carré et 5 à 10 millisecondes avec une portée de 10.

Placez la glissière sur le stade du micromanipulateur et brossez le bord de l’aiguille contre le bord de la bande à double face à un angle de 45 degrés pour créer une pointe légèrement inclinée cassée juste assez pour permettre l’écoulement du dextran de 10 kilodaltons à travers l’ouverture. Pomper la pédale jusqu’à ce que le colorant soit au bout de l’aiguille. Alignez l’aiguille de sorte qu’elle soit parallèle à l’embryon et perforez l’extrémité postérieure du spécimen.

Pompez la pédale pour injecter deux nanolitres de colorant dans le spécimen. Notez l’heure de l’injection à des fins d’incubation et continuez la glissade pour injecter d’autres spécimens. Pour l’injection larvaire, faire une ouverture inclinée légèrement plus grande que celle qui est utilisée pour l’injection d’embryons et l’angle de l’aiguille légèrement vers le bas vers le spécimen avant d’injecter aux larves avec 220 nanolitres similaires à ce qui a été démontré pour les spécimens embryonnaires.

À la fin de l’incubation par injection de 10 minutes, utilisez un applicateur à pointe de coton pour appliquer de la gelée de pétrole sur les côtés droit et gauche des échantillons sur la lame en tant qu’espaceur. Placez le slip de couverture sur le dessus et placez la lame sur l’étape du microscope confoccal. Sélectionnez l’objectif 20X et imagez les échantillons dans toute la profondeur de chaque embryon.

Calculez ensuite le pourcentage d’échantillons avec une barrière céphalo-encéphalique compromise selon la formule. Avant de commencer la procédure de dissection, utilisez du vernis à ongles pour monter deux glissements de couverture espacés d’environ 0,5 centimètre sur une glissière et placez une larve injectée dans le PBS sur la glissière à la fin de l’incubation de 30 minutes. À l’aide d’une paire de forceps, saisir la larve à mi-chemin dans le corps larvaire et utiliser une deuxième paire de forceps pour séparer les moitiés antérieures et postérieures de la larve.

Ensuite, utilisez une paire de forceps pour saisir la région antérieure aux crochets de bouche et utilisez la deuxième paire de forceps pour inverser la paroi du corps sur la pointe de la première paire de forceps. Le cerveau et le cordon nerveux ventral seront exposés. Séparez le cerveau et le cordon nerveux ventral de la paroi du corps en séparant les nerfs si nécessaire et en enlevant la paroi du corps de la lame.

Couvrir l’échantillon de 10 microlitres de 80% de glycérol. Ensuite, placez un bordereau de couverture sur le dessus de l’échantillon pour l’imagerie et l’image des échantillons pour déterminer le pourcentage d’échantillons avec une barrière céphalo-encéphalique compromise comme démontré. Lorsque des embryons de type sauvage en phase tardive 17 sont injectés avec 10 kilodaltons dextran conjugués à la sulforhodamine 101 colorant fluorescent au chlorure acide, la grande molécule de dextran est exclue du cordon nerveux ventral, comme prévu.

Hétérozygotes bruts 1 embryons mutants présentent une barrière hé cerveau-cerveau intacte, semblable à celle observée dans les embryons de contrôle de type sauvage. En revanche, homozygous premières 1 embryons mutants présentent des défauts dans l’intégrité de la barrière céphalo-encéphalique, avec le dextran de 10 kilodaltons inondant dans le cordon nerveux ventral, indiquant un échec de la barrière céphalo-encéphalique à se former. Dans les échantillons larvaires de contrôle de type sauvage, 10 dextran kilodalton ne pénètre pas dans la barrière céphalo-cérébrale et est exclu du cerveau et du cordon nerveux ventral.

Lors de la tentative de cette procédure, le vieillissement approprié des embryons est essentiel pour s’assurer que les échantillons sont examinés à un âge où la formation de barrière céphalo-encéphalique devrait être complète. Après cette procédure, les mutants présentant une barrière céphalo-encéphalique compromise peuvent être étudiés à l’aide de la génétique, de l’immunohistochimie et de la microscopie pour mieux comprendre la fonction génique au niveau cellulaire. Cette technique permettra aux chercheurs d’identifier d’autres gènes essentiels à l’établissement et au maintien de la barrière céphalo-céphalique.