Nous nous intéressons à la découverte de nouveaux mécanismes cellulaires et moléculaires contrôlant la souche des cellules. Notre objectif principal est de déchiffrer comment les cellules souches évitent la différenciation dans les niches. Puisque nous travaillons dans des conditions expérimentales, il est essentiel de préserver l’intégrité des tissus pour s’assurer que les GSCs reçoivent un comportement physiologique.
Notre protocole maintient une niche de GSC saine et fonctionnelle permettant le suivi des GSC en division telles qu’elles le seraient in vivo. L’utilisation de l’imagerie à durée de vie prolongée nous permet d’étudier l’ensemble du cycle cellulaire des CSG et la dynamique des spectrosomes. Plus précisément, nous réussissons à caractériser les changements de spectrosome tout au long du cycle cellulaire, une tâche qui était auparavant difficile à réaliser avec des images fixes ou des périodes d’imagerie plus courtes.
Savoir comment réaliser principalement des expériences sans affecter sa dynamique nous permet d’explorer comment les cellules de niche communiquent. Nous voulons étudier les mécanismes régulateurs de l’expression des gènes et du métabolisme cellulaire médiés par l’interaction directe entre les ARNm, des enzymes métaboliques dans la biologie des cellules souches. Pour commencer, préparez 100 aliquotes d’un microlitre du mélange d’antibiotiques à base de pénicilline streptomycine à une concentration de 10 000 unités par millilitre.
Préparez tous les autres réactifs nécessaires à la procédure et stockez-les de manière appropriée. Collectez des mouches âgées d’un à deux jours exprimant le par un exprimé de manière ubiquitaire et constitutive fusionnée à la GFP dans un nouveau tube. Cultivez les mouches pendant deux jours à 25 degrés Celsius dans un incubateur avant la dissection.
Placez une goutte de trois microlitres de l’adhésif Cell-Tak spécifique au centre de la lamelle d’une plaque de 35 millimètres recouverte de poly-D-lycine. Ajoutez immédiatement un volume égal de bicarbonate de sodium de 0,1 molaire avec un pH de huit à la goutte d’adhésif de trois microlitres. Mélangez la solution à l’aide d’une pipette.
Pour une évaporation complète, incubez la plaque avec son couvercle à température ambiante pendant 20 minutes. Conservez ensuite l’assiette à quatre degrés Celsius pendant la nuit. Après avoir décongelé la plaque le lendemain, lavez-la trois fois avec six microlitres d’eau pure en autoclave avec précaution sans toucher ni perturber la couche adhésive.
Laissez l’eau s’évaporer complètement à température ambiante pendant cinq à 10 minutes. Pour commencer, cultivez les mouches et préparez la plaque de fond en verre avec le revêtement. Nettoyez ensuite une boîte à trois puits de dissection, des pinces et des aiguilles de dissection avec de l’éthanol à 70 %.
Ajoutez environ 200 microlitres de solution de sonnerie dans chacun des trois puits de la boîte de dissection. À l’aide d’une pince, saisissez la femelle drosophile à l’intersection du thorax et de l’abdomen. Déchirez doucement la cuticule au niveau de la partie postérieure de l’abdomen et tirez-la vers l’arrière pour exposer les ovaires.
Après avoir disséqué les ovaires, transférez-les dans le puits suivant pour réduire la contamination par des restes de tissus ou des débris de la dissection. Sous un microscope stéréoscopique avec éclairage LED, utilisez une paire de pinces fines pour ancrer tout l’ovaire et la deuxième paire pour saisir une chambre d’œuf à un stade avancé. Étirez-vous doucement jusqu’à ce que la gaine musculaire se brise et soit à la traîne.
À l’aide d’une pince, transférez un à un les 15 à 20 ovaires sans gaine musculaire dans le troisième puits contenant 200 microlitres de milieu de sonnerie. Pré-mouillez un embout de 200 microlitres avec 0,1 % Tween 20 pour éviter que les ovaires ne collent à la paroi de l’embout. Transférez six microlitres de solution de ringer contenant les ovaires sans gaine musculaire à l’aide de l’embout pré-humidifié sur la plaque adhésive préparée à température ambiante.
À l’aide d’une aiguille de dissection ou d’une pince, appuyez soigneusement les ovaires au bas de la chute de la bague pour assurer le contact avec la surface adhésive. Ensuite, ajoutez trois millilitres de milieu de milieu Schneider’s, complété par un mélange d’antibiotiques à base de pénicilline 15 % FBS et 0,6 % de pénicilline streptomycine dans la plaque MatTek. Transportez la plaque contenant les ovaires sans gaine musculaire sur une surface plane jusqu’à la station de microscope.
Placez la plaque sur l’objectif 63x d’un microscope à disque rotatif ou d’un microscope confocal. Concentrez l’échantillon et sélectionnez le plan Z central pour chaque germanium. Pour configurer les paramètres expérimentaux, définissez le type de capture sur 3D time lapse.
Ajustez la puissance du laser à 70 % du maximum. Réglez la longueur d’onde d’excitation à 488 nanomètres. La gamme de piles Z est de 30 micromètres et la distance entre les piles Z de 1,2 micromètre.
Réglez l’intervalle entre les points temporels sur toutes les 10 minutes et la durée sur 17 heures. Si elle est disponible, utilisez l’option multi-positions pour redéfinir le XY des échantillons. Sélectionnez le plan Z au milieu de chaque germarium afin que les piles Z soient centrées à cette position et commencez l’acquisition.
Analysez les images dans le temps et le long de l’axe Z pour visualiser les changements dans la morphologie du spectrosome à l’aide du logiciel Imaris ou Image J. Pour créer les vidéos, sélectionnez manuellement le meilleur plan Z à chaque point temporel. Le signal GFP par un fort de la zone spectro ronde G2 a été significativement réduit pendant les phases G2 MG1.
Au cours de la prophase précoce, la GFP par un a quitté le spectrosome et a rempli le cytoplasme, indiquant l’entrée des cellules souches germinales dans la mitose. Après la mitose et la reformation de l’enveloppe nucléaire, le signal GFP par un s’est progressivement rétabli dans le cycle rond G1 Spectro. L’édition Denovo de GFP par un au spectrosome rond G1 a conduit à la formation de morphologies de spectrosomes en branche, en barre et en fusion.
