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Conservare tutta l&#39;acqua di mare o acqua di mare artificiale (SW), animali adulti, e le culture a 15 ° C per quanto è pratico. Assicurarsi che le uova e gli zigoti sono tenuti immersi in SW. Sali marini in commercio preparati ricostituiti con acqua distillata o di osmosi inversa serve pure una fonte di SW. Controllare la salinità con un densimetro e regolare sali o acqua per raggiungere livelli ottimali. Mantenere i livelli di peso specifico tra 1,020-1,025. Mantenere la vetreria e plasticware separato da tutti gli altri Equipaggiamento per evitare qualsiasi contaminazione con sostanze chimiche. Pulire embrione di grado da laboratorio risciacquando con acqua deionizzata o occasionale ammollo in ipoclorito di sodio diluito seguita da risciacquo più volte in acqua. 1 Ottenere e maturazione gameti provenienti da Patiria miniata Adulti <ol><li> Selezionare un animale per asportare gonadi. Determinare il sesso dopo l&#39;asportazione, cercando la presenza di ovaie o testicoli perché P. miniata non sono sexually dimorfismo. </li><li> Tagliare una piccola apertura, non più grande di 1 cm, lungo il lato di un braccio stella di mare con una lama di bisturi (Figura 1A). Utilizzo di piccole pinze blunt-ended tirare indietro bordi della incisione per accedere al tessuto gonade e tirare il tessuto delle gonadi attraverso l&#39;incisione. NOTA: Evitare di tirare fuori il tessuto intestinale, che è un allentato tessuto grigio o marrone (Figura 1B). Ovaie sono generalmente arancione, giallo o marrone chiaro (Figura 1C), mentre i testicoli sono di colore bianco o beige e quando perturbato causerà acqua di mare per diventare lattiginoso o nuvoloso in apparenza (Figura 1D). </li><li> Femmine Ritorno alle acquari. Isolare maschi per una o due ore in un contenitore di SW in quanto lo stress da manipolazione può indurre la deposizione delle uova. Animali guariscono lungo il sito di incisione e continuano a fornire gameti per diversi mesi. </li><li> Raccogliere testicoli in una provetta Eppendorf da 1,5 ml con il minor SW possibile e conservare in ghiaccio fino al momento dell&#39;uso. Memorizzare qualsiasi testicoli non cied il giorno della raccolta a 4 ° C per un massimo di una settimana. </li><li> Raccogliere ovaie in un piccolo piatto di coltura di vetro in diversi millilitri di SW. Per rilasciare gli ovociti dal tessuto ovario, prendere in giro a parte il tessuto con due paia di pinze finché non rimangono pezzi di grandi dimensioni. NOTA: In modo ottimale, la maggior parte degli ovociti sono completamente sviluppati. Tali ovociti sono grandi, rotondi, e chiaro marrone giallo o chiaro con una vescicola germinale distinta nell&#39;ovocita (Figura 2A), rispetto al sottoinsieme di ovociti non sviluppati che sono più piccoli, marrone, granulosa, e opaco (Figura 2B). Se è maggiore di circa il 25% degli ovociti sono della varietà sviluppata, selezionare una femmina diversa per ottenere ovociti. </li><li> Versare gli ovociti e tessuto rimanente attraverso una tazza filtro in maglia con dimensione dei pori di 200 micron e raccogliere il flusso attraverso. Questo conterrà tutte le varietà di ovociti, ma rimuovere il tessuto ovarico. Sloggiare rimanenti ovociti dal tessuto catturati dal filtro a spruzzo wesima SW da una bottiglia a zampillo. Filtrare tazze sono realizzati con un tubo da 50 ml (Figura 3A-A &#39;). </li><li> Versare il flusso attraverso dal passaggio 1.6 attraverso un 100 micron tazza filtro a rete. Eliminare piccoli ovociti in flusso attraverso. Grandi ovociti pienamente sviluppati che sono pronti per la maturazione rimarrà sul filtro. Risciacquare gli ovociti in un bicchiere pulito 200 ml. </li><li> Aggiungere 95 ml di SW per il bicchiere di vetro 200 ml di ovociti. Aggiungere 5 ml di 200 mM 1-metiladenina per una concentrazione finale di 10 mM. </li><li> Trasferire gli ovociti ad un grande piatto di cultura superficiale e posto a 15 ° C. Una zona ad alta superficie piatto cultura del volume consente lo scambio di ossigeno. Gli ovociti non maturi o non possono sviluppare bene se sono sovraffollate durante questa fase di maturazione. Suddiviso in diversi piatti di SW oltre 10 mM 1-methlyadenine fino a quando la cultura è inferiore a 200 ovociti / ml. </li><li> Lasciare gli ovociti a maturare per 45-90 minuti, ma non più come questo renderà gli ovociti in grado di essere fertilized. Per determinare se la maturazione è completa, guardare gli ovociti in un ambito dissezione. Le vescicole germinali si muove verso e fonde con la membrana cellulare durante la maturazione. E poi si rompe e quindi non è più visibile in ovociti maturi (Figura 2C). </li></ol> 2 Concimazione di ovociti maturi <ol><li> Ha scelto un piccolo gruppo di tessuto testicolare, circa pisello, e tritare in un piccolo piatto di coltura in vetro con circa 1 ml di SW. </li><li> Utilizzare una pipetta Pasteur per trasferire 2-3 gocce di acqua di mare lattiginoso risultante a circa 100 ml di ovociti maturi e agitare il piatto cultura per mescolare. Evitare il trasferimento di pezzi di tessuto testicolare. Evitare l&#39;aggiunta di maggiori quantità di sperma in quanto ciò potrebbe causare polispermia e successivo sviluppo poveri. </li><li> Dopo alcuni minuti di osservare gli ovociti in un ambito dissezione. Uova fecondate, o zigoti, hanno una busta di fecondazione, che è una cupola trasparente che si alza dal cell membrana (Figura 2D). NOTA: Non procedere con la cultura, se inferiore al circa il 90% di uova fertilizzare in quanto i tassi di fecondazione poveri sono un&#39;indicazione di una cultura malsana che non può anche svilupparsi bene. </li><li> Dopo la fecondazione è completata, cambiare il SW sulle zigoti versando attraverso un filtro a maglia 100 micron e risciacquo in un piatto di cultura con SW fresca. E &#39;importante rimuovere lo sperma in eccesso per evitare carenza di ossigeno. Posizionare il piatto di coltura a 15 ° C per 15-30 min. </li></ol> 3 De-gelificante e Rowing fertilizzato le uova <ol><li> Preparare piatti iniezione prendendo il coperchio da una piastra di Petri di 60 x 15 mm in polistirene. <ol><li> Tracciare una linea di pennarello indelebile sul retro del piatto, intorno alla zona che corrisponde al campo visivo del microscopio microiniezione. Questo assicura che tutti gli embrioni filari sono all&#39;interno del campo di vista del microscopio. </li><li> Utilizzare una pipetta Pasteur di vetro a segnare una linea attraverso il cerchio, preferably su un lato del cerchio (Figura 3B). Utilizzare questa linea in seguito a rompere aghi da iniezione (punto 4.5). NOTA: I reagenti comunemente utilizzati per aderire embrioni di riccio di mare, ad esempio, protamina solfato o poli-L Lisina, sono inutili. De-gelatina P. zigoti miniata aderiscono molto bene alla plastica non patinata. Si noti che non si attacchino bene a piatti di vetro. </li></ol></li><li> Aggiungere circa 10 ml SW per ogni piatto in modo che la superficie è coperta, ma l&#39;acqua non schizzare troppo nel piatto in quanto ciò potrebbe turbare gli embrioni filari più. </li><li> Rimuovere il P. miniata cappotto gelatina zigote con SW acido prima di canottaggio. Questo cappotto gelatina è più ampio di quello osservato per le specie di riccio di mare modello. <ol><li> Preparare acido SW nel range di pH 4,0-4,2. Il pH è fondamentale per consentire la rimozione efficace del cappotto gelatina pur permettendo il normale sviluppo. </li><li> Aggiungere singole gocce di 1 N (1 M) HCl in SW di un 1 L stock di SW. Consentire ad ogni goccia per mescolare completamentee monitorare il pH prima di aggiungere altro HCl. NOTA: Uno a diversi ml di HCl risultati del pH del caso, ma non aggiungere l&#39;intero volume in una sola volta. NOTA: Preparare 1 N HCl in cappa con SW e 12 N (12 M) HCl. </li><li> Rimuovere SW su zigoti da loro versando su un filtro a maglia 100 micron. Risciacquare in un becher da 200 ml nella più piccola quantità di SW possibile (circa 10 ml). Riempire il bicchiere fino a 150 ml con SW acido (pH 4.0) e consentire gli zigoti di sedersi nel SW acido per 3 min. </li></ol></li><li> Striscia gelatina cappotto dalle zigoti versando avanti e indietro tra due bicchieri da 200 ml, ogni volta che passa gli zigoti attraverso un filtro a maglie di 200 micron. Versare gli zigoti attraverso il filtro intorno 5-10x sopra su una finestra di tempo 2 min. </li><li> Rimuovere SW acido versando gli zigoti su un filtro a maglia 100 micron. Sciacquare gli zigoti in un piccolo piatto di coltura di vetro con SW. De-zigoti in gelatina possono attenersi a piatti di plastica. Embrioni immediatamente Row; cominciano a produrre più jelly cappotto che porta a scarsa adesione ai piatti di plastica nel tempo. </li><li> Utilizzare una pipetta a bocca (Figura 3C-C &#39;) per prendere zigoti dalla cultura piatto di vetro e metterli in linee rette sulle stoviglie di iniezione. Sciogliere il centro del lato sottile di una pipetta Pasteur a fuoco finché il vetro è morbido. Rapidamente tirare le estremità del vetro a parte per produrre un sottile tratto di vetro. Una volta che il vetro è freddo, rompere la piccola estremità della pipetta Pasteur (per ulteriori informazioni sulla preparazione di una pipetta a bocca vedere Wessel et al., 2004 17 o Dolce et al., 2004 18). <ol><li> Effettuare una pipetta remi tale che il diametro è appena superiore al diametro degli embrioni in modo che solo un singolo zigote sarà entrare ed uscire dalla pipetta alla volta. Ciò consentirà una singola riga per formare. Piccole pipette di diametro possono togliere la busta fecondazione e disturbare gli zigoti come P. zigoti miniata non hanno una membrana ialina unnd sono abbastanza morbido. </li><li> Se gli zigoti non si attacchino al piatto di plastica, li conserva per più tempo a SW acido (fino a diversi minuti). In alternativa, una pipetta di diametro inferiore può essere di aiuto nella rimozione cappotto gelatina per consentire gli zigoti per attaccare in modo più efficace. </li><li> Gli zigoti sono leggermente assetto positivo e tendono a galleggiare o soffermarsi appena sopra il fondo del piatto. In questo caso, posizionare la pipetta remi modo che gli zigoti pigiate delicatamente sulla superficie del piatto che escono dalla pipetta (Figura 3D). NOTA:. E &#39;possibile montare in molte righe su questi piatti P. membrane embrionali miniata non diventano più difficili da penetrare nel tempo e quindi si può iniettare centinaia di zigoti su un singolo piatto. </li></ol></li></ol> 4 Iniezione di zigoti <ol><li> Preparare le soluzioni di iniezione con adeguate concentrazioni di oligonucleotidi antisenso morfolino (MASO), mRNA, o DNA in una conc finaleentration di KCl 200 mM. 400-800 micron MASO e 2,5 ng / ml di DNA tendono a produrre fenotipi morphant riducendo al minimo la tossicità. La concentrazione finale l&#39;uovo sarà 1/125 ° della concentrazione di partenza 14. Per soluzioni contenenti iniezione MASOS, calore a 65 ° C per 5 min immediatamente prima dell&#39;uso e quindi memorizzare a temperatura ambiente. <ol><li> Per facilità di classificare gli embrioni iniettati, aggiungere rodamina destrano tracciante alla soluzione iniettabile per ottenere una concentrazione di 0,1%. </li></ol></li><li> Preparare aghi da iniezione tirando tubo capillare di vetro (1,0 millimetri OD ID x 0,75 mm, 100 mm di lunghezza) in un ago di trazione strumento seguendo le istruzioni del produttore. Aghi adatti per l&#39;iniezione di ricci di mare anche funzionare bene per le stelle di mare, in modo da utilizzare parametri simili 19. </li><li> Caricare circa 2 ml di soluzione iniettabile in un ago per iniezione con una punta microloader pipetta. </li><li> Inserire l&#39;estremità smussata dell&#39;ago nel manipulator. Impostare picospritzer a 100 impulsi msec e una pressione d&#39;aria di 40 PSI. </li><li> Posizionare un piatto di embrioni filari sul palco microscopio e hanno tutti gli embrioni nel campo visivo. Orientate il piatto in modo che la linea è segnato sul lato più vicino all&#39;ago. Posizionare l&#39;ago con un angolo di circa 60 ° in modo che la punta si trova vicino al centro della linea e appena sopra la superficie dell&#39;acqua. </li><li> Focus sulla linea segnata e abbassare l&#39;ago fino a quando la punta è a fuoco. Abbassare la punta un po &#39;di più e rompere aperto eseguendo delicatamente nelle creste della linea segnata. Sollevare la punta dalla superficie del piatto e posizionarlo nella parte superiore della prima riga di zigoti e concentrarsi sulle zigoti. </li><li> Abbassare la punta in modo che questo impalare il centro di zigote provenienti da circa un angolo di 60 °. L&#39;ago penetra facilmente P. zigoti miniata. Passo sul pedale (o altri mezzi di forzatura materiale dal ago per iniezione) per introdurre un bolo di Injesoluzione ction in embrione. </li><li> Obiettivo per un bolo che è del 20-30% del diametro dell&#39;embrione, o tra 25 e 80 pl. Se il bolo è più grande o più piccolo di questo, regolare la durata dell&#39;iniezione sul picospritzer e iniettare il prossimo embrione. Continuare a regolare la durata per ottenere la dimensione del bolo desiderata. Inizia a 100 msec durata. Re-rompere l&#39;ago se maggiore di circa 200 msec è necessario per introdurre il bolo appropriato. Gettare l&#39;ago e preparare una nuova se è necessaria meno di 15-20 msec per ottenere queste dimensioni bolo come la dimensione dell&#39;ago è troppo grande e può disturbare il normale sviluppo. </li><li> Procedere per iniettare i restanti zigoti sul piatto di iniezione. Gli embrioni possono facilmente essere iniettato fino a quando inizia la scissione e in singoli blastomeri dopo la prima scissione. Periodicamente sollevare l&#39;ago sopra la superficie dell&#39;acqua per rimuovere zigoti che sporgono sull&#39;ago. Se necessario ri-rompere la punta dell&#39;ago o caricare un nuovo ago se si verifica un blocco. </li></ol><ol><li> Lasciare gli embrioni si sviluppano a 15 ° C a SW. Mantenere elevata superficie e il volume nelle colture per consentire lo scambio di ossigeno. Assicurarsi che gli embrioni non sono affollate; tenere culture pari o inferiore a 200 embrioni / ml. A seconda della fase desiderata embrionale, prevede di raccogliere embrioni iniettati in circa 20-24 ore dopo la fecondazione. NOTA: Questo è spesso il momento ideale per ordinare e raccogliere e perché normalmente gli embrioni in via di sviluppo sono facilmente distinguibili morfologicamente, ma non sono ancora nuoto. </li><li> Se gli embrioni sono nati, salateli leggermente scossa per evitare il nuoto. Aggiungere 200 ml di NaCl 5 M a 10 ml di SW nel piatto iniezione mentre delicatamente roteare il SW. Dopo pochi minuti, gli embrioni cadranno al fondo del piatto. Raccogliere questi e spostarli alla normalità SW salinità. </li><li> Raccogliere embrioni iniettati sotto una sorgente luminosa fluorescente appropriato compatibile con il tracciante utilizzato nella injectisulla soluzione. Se non è stato utilizzato alcun tracciante, sorta di selezionare gli embrioni per la morfologia normale. </li><li> Usando una pipetta a bocca, disegnare fluorescente embrioni con una quantità minima di SW e soffiare fuori in un piccolo piatto pieno di cultura SW. Pipette bocca ideali hanno una grande apertura sufficiente per gli embrioni di essere tirato dentro e fuori senza danneggiarli, ma non così grande che gli embrioni indesiderati e SW estranei sono anche tirato su. </li><li> Una volta che tutti gli embrioni desiderati sono stati raccolti nel nuovo piatto, osservare gli embrioni sotto la luce fluorescente e rimuovere eventuali embrioni non-iniettato o embrioni poco sviluppati. </li><li> Cultura allineati embrioni a stadi desiderati in un incubatore e procedere con l&#39;imaging o altri protocolli desiderati. </li></ol>

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Nessun conflitto di interessi dichiarati dagli autori.

Ci sono due passaggi critici che sono difficili per gli utenti meno esperti di questa tecnica, ma sono essenziali per la creazione di embrioni con successo morphant. La prima è la selezione ovociti sani che matureranno e fertilizzare correttamente. La percentuale di sviluppo normale in una cultura dipende dalla stagione, la salute dell&#39;animale, e il numero di volte che gli ovociti sono stati raccolti da un singolo individuo. Gli oociti tendono ad essere di qualità migliore da aprile a ottobre. E &#39;importante gu...

La stella di mare, Patiria miniata, (comunemente noto come la stella pipistrello) sta emergendo come un interessante e versatile sistema modello per una varietà di cellulare da 1 a 3, dello sviluppo 4,5, evolutiva 6- 8, e studi ecologici 9- 11. Adult P. miniata sono distribuiti lungo la costa del Pacifico da Sitka, in Alaska a Baja, California 12 e sono facilmente mantenuti in acquari marini. Gli ovociti sono tutto l&#39;anno ottenibili e ogni femmina può gettare decine di migliaia di uova. Gli ovociti sono facilmente maturati e fecondati esternamente 13. Gli embrioni risultanti sono trasparenti consentendo una facile osservazione; si sviluppano in modo sincrono, e richiedono solo acqua di mare per lo sviluppo. Assemblaggio del genoma intero e più trascrittomi sono disponibili anche P. miniata ( <a href="http://www.echinobase.org/Echinobase/">Echinobase.org</a> ). Tali vantaggi li rendono ideali per una gamma di ricercae scopi didattici. Negli ultimi anni, P. miniata è diventato un sistema modello per gene dello sviluppo della rete di regolamentazione analizza 14- 16. Lo scopo di questi studi è quello di identificare l&#39;intero complimento di geni regolatori e determinare la rete delle loro interazioni. Molto di questo lavoro comporta l&#39;espressione genica perturbante attraverso l&#39;introduzione di oligonucleotidi antisenso o in mRNA sintetizzato in vitro. Inoltre, le analisi normative cis sono utilizzati per caratterizzare la funzione del DNA di regolamentazione 15. Queste analisi richiedono l&#39;introduzione di reagenti perturbazione e / o giornalista DNA costrutti in embrioni. Inoltre, per caratterizzare gli effetti a valle di tali perturbazioni, si deve eseguire il test di molti embrioni per cambiamenti nell&#39;espressione genica di potenziali bersagli. Tecniche di microiniezione di molte centinaia di zigoti sono centrali per questo lavoro. Echinodermi, tra cui P. miniata </em&gt;, richiedono molti mesi per raggiungere la maturità sessuale. A causa di questo, generalmente non è pratico per sviluppare e mantenere linee transgeniche di questi animali per la sperimentazione. Pertanto, l&#39;allevamento di adulti transgenici non può in modo efficiente creare embrioni modificati. Invece, perturbazione deve avvenire de novo attraverso la microiniezione. Microiniezione offre l&#39;opportunità di modificare gli embrioni con reagenti che non sono cellula-permeabili. Il seguente protocollo descrive un metodo per introdurre il DNA, mRNA, traccianti cellulari, e oligonucleotidi antisenso morfolino in centinaia di uova fecondate in un 2-3 ore seduto attraverso microiniezione. Questo produce materiale sufficiente per una serie di esperimenti a valle tra cui, ma non limitato a, qPCR, ibridazione in situ, RNA-Seq, e western blotting.

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		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:147px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">1-Methyladenine</td>
			<td style="width:147px;">Acros Organics (Fisher Scientific)</td>
			<td style="width:119px;">AC20131-1000</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">190 micron nitex nylon filter</td>
			<td style="width:147px;">Small Parts (originally Sefar)</td>
			<td style="width:119px;">CMN-0185-C/5PK-05</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">100 micron nitex nylon filter</td>
			<td style="width:147px;">Small Parts (originally Sefar)</td>
			<td style="width:119px;">CMN-0105-C/5PK-05</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Polystyrene Petri Dishes, 60mm x 15mm</td>
			<td style="width:147px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">FB0875713A</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Capillary tubing</td>
			<td style="width:147px;">FHC, Inc</td>
			<td style="width:119px;">30-30-0</td>
			<td style="width:167px;">For pulling microinjection needles</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Model P-97 Needle Puller</td>
			<td style="width:147px;">Sutter Instruments</td>
			<td style="width:119px;">P-97</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="101">
			<td height="101" style="height:101px;width:216px;">Dextran, Rhodamine Green</td>
			<td style="width:147px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">D7163</td>
			<td style="width:167px;">If injecting a GFP expression reporter, it is helpful to substitute Texas Red dextran as an injection tracer</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Instant Ocean Sea Salt</td>
			<td style="width:147px;">Doctors Foster and Smith</td>
			<td style="width:119px;">CD-116528</td>
			<td style="width:167px;">Also available in many pet stores</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Microloader Tips</td>
			<td style="width:147px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">5242 956.003</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a method for microinjection of patiria minata zygotes

Echinodermi sono stati a lungo un sistema modello preferito per gli studi di riproduzione e sviluppo, e più recentemente per lo studio della regolazione genica e di evoluzione dei processi di sviluppo. La stella di mare, Patiria miniata, sta guadagnando prevalenza come sistema modello per questo tipo di studi, che in precedenza erano svolte quasi esclusivamente nei ricci di mare, Strongylocentrotus purpuratus e Lytechinus variegatus. Un vantaggio di questi sistemi modello è la facilità di produzione di embrioni modificati in cui un particolare gene è attivo o inibiti, etichettare un gruppo di celle, o introdurre un gene reporter. Un metodo microiniezione unico è in grado di creare un&#39;ampia varietà di tali embrioni modificati. Qui, vi presentiamo un metodo per ottenere gameti da P. miniata, producendo zigoti, e l&#39;introduzione di reagenti perturbanti tramite microiniezione. Embrioni sani morphant sono successivamente isolati per studi quantitativi e qualitativi di gefunzione ne. La disponibilità di genoma e trascrittoma dati di questo organismo ha aumentato i tipi di studi che vengono eseguite e la facilità di loro esecuzione.

L&#39;obiettivo di questo protocollo è quello di introdurre i reagenti in embrioni. Dimostriamo l&#39;efficacia del protocollo iniettando un giornalista costrutto di DNA che guida l&#39;espressione della proteina fluorescente verde (GFP). Embrioni iniettati esprimono GFP a chiazze clonali (Figura 4A-B) in quanto incorpora il DNA durante la prima scissione. Molti reagenti che sono auspicabile introdurre in embrioni sono tossici in quantità elevate e per lotti non ottimali di embrioni. Manifesti di toss...

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A Method for Microinjection of Patiria minata Zygotes

I metodi che producono embrioni morphant sono essenziali per studiare i meccanismi di sviluppo e reti di regolazione genica. La stella di mare Patiria miniata è un sistema modello emergente per questi studi. Qui vi presentiamo un protocollo per l&#39;ottenimento di gameti, la produzione di colture di embrioni, e la rapida microiniezione di zigoti di questa specie.

Un metodo per la microiniezione di<em&gt; Patiria minata</em&gt; zigoti

Echinoderms have long been a favorite model system for studies of reproduction and development, and more recently for the study of gene regulation and ...

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Research

JoVE Journal

Biology

A Method for Microinjection of Patiria minata Zygotes

10.9K Views.  Carnegie Mellon University.  I metodi che producono embrioni morphant sono essenziali per studiare i meccanismi di sviluppo e reti di regolazione genica. La stella di mare Patiria miniata è un sistema modello emergente per questi studi. Qui vi presentiamo un protocollo per l'ottenimento di gameti, la produzione di colture di embrioni, e la rapida microiniezione di zigoti di questa specie. 

Video: A Method for Microinjection of Patiria minata Zygotes

Microinjection of A. aegypti Embryos to Obtain Transgenic Mosquitoes

In this video, Nijole Jasinskiene demonstrates the methodology employed to generate transgenic Aedes aegypti mosquitoes, which are vectors for dengue fever.  The techniques for correctly preparing microinjection needles, dessicating embryos, and performing microinjection are demonstrated.

In this video, Nijole Jasinskiene demonstrates the methodology employed to generate transgenic Aedes aegypti mosquitoes, which are vectors for dengue fever. The techniques for correctly preparing microinjection needles, dessicating embryos, and performing microinjection are demonstrated.

Microiniezione di A. aegypti embrioni per ottenere zanzare transgeniche

In this video, Nijole Jasinskiene demonstrates the methodology employed to generate transgenic Aedes aegypti mosquitoes, which are vectors for dengue ...

Ricerca

Biologia

Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1. The plasmid DNA rearranges to form extrachromosomal concatamers that are stably inherited, though not with the same efficiency as actual chromosomes 2. A gene of interest is co-injected with an obvious phenotypic marker, such as rol-6 or GFP, to allow selection of transgenic animals under a dissecting microscope. The exogenous gene may be expressed from its native promoter for cellular localization studies. Alternatively, the transgene can be driven by a different tissue-specific promoter to assess the role of the gene product in that particular cell or tissue. This technique efficiently drives gene expression in all tissues of C. elegans except for the germline or early embryo 3. Creation of transgenic animals is widely utilized for a range of experimental paradigms. This video demonstrates the microinjection procedure to generate transgenic worms. Furthermore, selection and maintenance of stable transgenic C. elegans lines is described.

This video demonstrates the technique of microinjection into the gonad of C. elegans to create transgenic animals.

Generazione di Stabile transgenici C. elegans Utilizzando Microiniezione

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1.  The plasmid DNA rearranges to ...

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo (New Culture)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  the formation and patterning of brain, neural tube, somite and heart primordia. Applications of chick embryo culture include electroporation of DNA or RNA constructs in order to analyze gene function, grafts of growth factor coated beads such as FGFs and BMPs , as well as whole mount in situ hybridization and immunohistochemistry. This video demonstrates the different steps in chick embryo culture; First, the embryo is explanted in saline. Then, the embryo is centered on a glass ring. The membranes surrounding the embryo are lifted along the walls of the ring. The ring is then placed in a culture dish containing a pool of albumine. The culture dish is sealed and placed in a humid chamber, where the embryo is cultured for up to 24 hrs. Finally, the embryo is removed from the ring, fixed and processed for further applications. A troubleshooting guide is also presented.

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo New Culture

This video demonstrates New culture, a method by which chick embryos are cultured outside the egg for up to 24 hr. This method enables one to study early development (primitive streak to 14 som.), a period corresponding to E7-9 in mouse. Applications of this technique include electroporation, in situ hybridization and immunohistochemistry.

Metodo per la Cultura di Chick primi embrioni ex vivo (Nuova Cultura)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Microinjection of Medaka Embryos for use as a Model Genetic Organism

In this video, we demonstrate the technique of microinjection into one-cell stage medaka embryos. Medaka is a small egg-laying freshwater fish that allows both genetic and embryological analyses and is one of the vertebrate model organisms in which genome-wide phenotype-driven mutant screens were carried out 1, as in zebrafish and the mouse. Divergence of functional overlap of related genes between medaka and zebrafish allows identification of novel phenotypes that are unidentifiable in a single species 2, thus medaka and zebrafish are complementary for genetic dissection of vertebrate genome functions.
To take advantage of medaka fish whose embryos are transparent and develop externally, microinjection is an essential technique to inject cell-tracers for labeling cells, mRNAs or anti-sense oligonucleotides for over-expressing and knocking-down genes of interest, and DNAs for making transgenic lines.

Medaka and zebrafish are complementary for genetic dissection of vertebrate genome functions. This protocol highlights the key points for successful microinjection into medaka embryos, an important technique for embryological and genetic analysis using medaka and zebrafish in a laboratory.

Microiniezione di embrioni Medaka per essere utilizzato come organismo modello genetico

In this video, we demonstrate the technique of microinjection into one-cell stage medaka embryos. Medaka is a small egg-laying freshwater fish that allows ...

Analysis of mRNA Nuclear Export Kinetics in Mammalian Cells by Microinjection

In eukaryotes, messenger RNA (mRNA) is transcribed in the nucleus and must be exported into the cytoplasm to access the translation machinery. Although the nuclear export of mRNA has been studied extensively in Xenopus oocytes1 and genetically tractable organisms such as yeast2 and the Drosophila derived S2 cell line3, few studies had been conducted in mammalian cells. Furthermore the kinetics of mRNA export in mammalian somatic cells could only be inferred indirectly4,5. In order to measure the nuclear export kinetics of mRNA in mammalian tissue culture cells, we have developed an assay that employs the power of microinjection coupled with fluorescent in situ hybridization (FISH). These assays have been used to demonstrate that in mammalian cells, the majority of mRNAs are exported in a splicing dependent manner6,7, or in manner that requires specific RNA sequences such as the signal sequence coding region (SSCR) 6. In this assay, cells are microinjected with either in vitro synthesized mRNA or plasmid DNA containing the gene of interest. The microinjected cells are incubated for various time points then fixed and the sub-cellular localization of RNA is assessed using FISH. In contrast to transfection, where transcription occurs several hours after the addition of nucleic acids, microinjection of DNA or mRNA allows for rapid expression and allows for the generation of precise kinetic data.

Here we describe an assay that employs the power of microinjection coupled with fluorescent in situ hybridization in order to accurately measure the nuclear export kinetics of mRNA in mammalian somatic cells.

Analisi della cinetica di esportazione mRNA nucleare in cellule di mammifero da Microiniezione

In eukaryotes, messenger RNA (mRNA) is transcribed in the nucleus and must be exported into the cytoplasm to access the translation machinery. Although ...

Flow Cytometry-based Purification of S. cerevisiae Zygotes

Zygotes are essential intermediates between haploid and diploid states in the life cycle of many organisms, including yeast (Figure 1) 1. S. cerevisiae zygotes result from the fusion of haploid cells of distinct mating type (MATa, MATalpha) and give rise to corresponding stable diploids that successively generate as many as 20 diploid progeny as a result of their strikingly asymmetric mitotic divisions 2. Zygote formation is orchestrated by a complex sequence of events: In this process, soluble mating factors bind to cognate receptors, triggering receptor-mediated signaling cascades that facilitate interruption of the cell cycle and culminate in cell-cell fusion. Zygotes may be considered a model for progenitor or stem cell function.
Although much has been learned about the formation of zygotes and although zygotes have been used to investigate cell-molecular questions of general significance, almost all studies have made use of mating mixtures in which zygotes are intermixed with a majority population of haploid cells 3-8. Many aspects of the biochemistry of zygote formation and the continuing life of the zygote therefore remain uninvestigated.
Reports of purification of yeast zygotes describe protocols based on their sedimentation properties 9; however, this sedimentation-based procedure did not yield nearly 90% purity in our hands. Moreover, it has the disadvantage that cells are exposed to hypertonic sorbitol. We therefore have developed a versatile purification procedure. For this purpose, pairs of haploid cells expressing red or green fluorescent proteins were co-incubated to allow zygote formation, harvested at various times, and the resulting zygotes were purified using a flow cytometry-based sorting protocol. This technique provides a convenient visual assessment of purity and maturation. The average purity of the fraction is approximately 90%. According to the timing of harvest, zygotes of varying degrees of maturity can be recovered. The purified samples provide a convenient point of departure for "-omic" studies, for recovery of initial progeny, and for systematic investigation of this progenitor cell.

Flow Cytometry-based Purification of S. cerevisiae Zygotes

To purify zygotes of S. cerevisiae, haploid cells of opposite mating type were engineered to express red or green fluorescent proteins, co-incubated to allow zygote formation, and fractionated using a flow cytometry-based protocol. The highly-enriched fraction enables subsequent "-omic" studies, recovery of initial progeny, and systematic investigation of zygote morphogenesis.

Flusso Cytometry basata Purificazione<em&gt; S. cerevisiae</em&gt; Zigoti

Zygotes are essential intermediates between haploid and diploid states in the life cycle of many organisms, including yeast (Figure 1) 1. S. cerevisiae ...

Single-cell Microinjection for Cell Communication Analysis

Gap junctions are intercellular channels that allow the communication of neighboring cells. This communication depends on the contribution of a hemichannel by each neighboring cell to form the gap junction. In mammalian cells, the hemichannel is formed by six connexins, monomers with four transmembrane domains and a C and N terminal within the cytoplasm. Gap junctions permit the exchange of ions, second messengers, and small metabolites. In addition, they have important roles in many forms of cellular communication within physiological processes such as synaptic transmission, heart contraction, cell growth and differentiation. We detail how to perform a single-cell microinjection of Lucifer Yellow to visualize cellular communication via gap-junctions in living cells. It is expected that in functional gap junctions, the dye will diffuse from the loaded cell to the connected cells. It is a very useful technique to study gap junctions since you can evaluate the diffusion of the fluorescence in real time. We discuss how to prepare the cells and the micropipette, how to use a micromanipulator and inject a low molecular weight fluorescent dye in an epithelial cell line.

We describe here how to perform a single-cell microinjection of Lucifer Yellow to visualize cellular communication via gap-junctions in living cells, and provide some useful tips. We expect that this paper will help everyone to evaluate the degree of cellular coupling due to functional gap junctions. Everything described here could be, in principle, adapted to other fluorescent dyes with molecular weight below 1,000 Daltons.

Microiniezione cella singola per l&#39;analisi cellulare comunicazione

Gap junctions are intercellular channels that allow the communication of neighboring cells. This communication depends on the contribution of a ...

High Throughput Microinjections of Sea Urchin Zygotes

Microinjection into cells and embryos is a common technique that is used to study a wide range of biological processes. In this method a small amount of treatment solution is loaded into a microinjection needle that is used to physically inject individual immobilized cells or embryos. Despite the need for initial training to perform this procedure for high-throughput delivery, microinjection offers maximum efficiency and reproducible delivery of a wide variety of treatment solutions (including complex mixtures of samples) into cells, eggs or embryos. Applications to microinjections include delivery of DNA constructs, mRNAs, recombinant proteins, gain of function, and loss of function reagents. Fluorescent or colorimetric dye is added to the injected solution to enable instant visualization of efficient delivery as well as a tool for reliable normalization of the amount of the delivered solution. The described method enables microinjection of 100-400 sea urchin zygotes within 10-15 min.

Microinjection is a common technique used to deliver DNA constructs, mRNAs, morpholino antisense oligonucleotides or other treatments into eggs, embryos, and cells of various species.

High Throughput microiniezioni di Sea Urchin zigoti

Microinjection into cells and embryos is a common technique that is used to study a wide range of biological processes. In this method a small amount of ...

In Vivo Microinjection and Electroporation of Mouse Testis

This video and article contribution gives a comprehensive description of microinjection and electroporation of mouse testis in vivo. This particular transfection technique for testicular mouse cells allows the study of unique processes in spermatogenesis.
The following protocol focuses on transfection of testicular mouse cells with plasmid constructs. Specifically, we used the reporter vector pEGFP-C1, which expresses enhanced green fluorescent protein (eGFP) and also the pDsRed2-N1 vector expressing red fluorescent protein (DsRed2). Both encoded reporter genes were under the control of the human cytomegalovirus immediate-early promoter (CMV).
For performing gene transfer into mouse testes, the reporter plasmid constructs are injected into testes of living mice. To that end, the testis of an anaesthetized animal is exposed and the site of microinjection is prepared. Our preferred place of injection is the efferent duct, with the ultimately connected rete testis as the anatomical transport route of the spermatozoa between the testis and the epididymis. In this way, the filling of the seminiferous tubules after microinjection is excellently managed and controlled due to the use of stained DNA solutions. After observing a sufficient filling of the testis by its colored tubule structure, the organ is electroporated. This enables the transfer of the DNA solution into the testicular&#160;cells. Following 3 days of incubation, the testis is removed and investigated under the microscope for green or red&#160;fluorescence, illustrating transfection success.
Generally, this protocol can be employed for delivering DNA- or RNA- constructs into living mouse testis in order to (over)express or knock down genes, facilitating in vivo gene function analysis. Furthermore, it is suitable for studying reporter constructs or putative gene regulatory elements. Thus, the main advantages of the electroporation technique are fast performance in combination with low effort as well as the moderate technical equipment and skills required compared to alternative techniques.

In Vivo Microinjection and Electroporation of Mouse Testis

This article describes microinjection and electroporation of mouse testis in&#160;vivo as a&#160;transfection technique for testicular mouse cells to study unique processes of spermatogenesis. The presented protocol involves steps of glass capillary preparation, microinjection via the efferent duct, and transfection by electroporation.

In Vivo Microiniezione e Elettroporazione di mouse Testicolo

This video and article contribution gives a comprehensive description of microinjection and electroporation of mouse testis in vivo. This particular ...

Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid decline in renal function and development of the clinical syndrome known as acute kidney injury (AKI). Pharmacological agents used to treat medical circumstances ranging from bacterial infection to cancer, when administered individually or in combination with other drugs, can initiate AKI. Zebrafish are a useful animal model to study the chemical effects on renal function in vivo, as they form an embryonic kidney comprised of nephron functional units that are conserved with higher vertebrates, including humans. Further, zebrafish can be utilized to perform genetic and chemical screens, which provide opportunities to elucidate the cellular and molecular facets of AKI and develop therapeutic strategies such as the identification of nephroprotective molecules. Here, we demonstrate how microinjection into the zebrafish embryo can be utilized as a paradigm for nephrotoxin studies.

Renal injuries incurred from nephrotoxins, which include drugs ranging from antibiotics to chemotherapeutics, can result in complex disorders whose pathogenesis remains incompletely understood. This protocol demonstrates how zebrafish can be used for disease modeling of these conditions, which can be applied to the identification of renoprotective measures.

Nefrotossina microiniezione in Zebrafish per creare un modello danno renale acuto

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...