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Conservare tutta l&#39;acqua di mare o acqua di mare artificiale (SW), animali adulti, e le culture a 15 ° C per quanto è pratico. Assicurarsi che le uova e gli zigoti sono tenuti immersi in SW. Sali marini in commercio preparati ricostituiti con acqua distillata o di osmosi inversa serve pure una fonte di SW. Controllare la salinità con un densimetro e regolare sali o acqua per raggiungere livelli ottimali. Mantenere i livelli di peso specifico tra 1,020-1,025. Mantenere la vetreria e plasticware separato da tutti gli altri Equipaggiamento per evitare qualsiasi contaminazione con sostanze chimiche. Pulire embrione di grado da laboratorio risciacquando con acqua deionizzata o occasionale ammollo in ipoclorito di sodio diluito seguita da risciacquo più volte in acqua. 1 Ottenere e maturazione gameti provenienti da Patiria miniata Adulti <ol><li> Selezionare un animale per asportare gonadi. Determinare il sesso dopo l&#39;asportazione, cercando la presenza di ovaie o testicoli perché P. miniata non sono sexually dimorfismo. </li><li> Tagliare una piccola apertura, non più grande di 1 cm, lungo il lato di un braccio stella di mare con una lama di bisturi (Figura 1A). Utilizzo di piccole pinze blunt-ended tirare indietro bordi della incisione per accedere al tessuto gonade e tirare il tessuto delle gonadi attraverso l&#39;incisione. NOTA: Evitare di tirare fuori il tessuto intestinale, che è un allentato tessuto grigio o marrone (Figura 1B). Ovaie sono generalmente arancione, giallo o marrone chiaro (Figura 1C), mentre i testicoli sono di colore bianco o beige e quando perturbato causerà acqua di mare per diventare lattiginoso o nuvoloso in apparenza (Figura 1D). </li><li> Femmine Ritorno alle acquari. Isolare maschi per una o due ore in un contenitore di SW in quanto lo stress da manipolazione può indurre la deposizione delle uova. Animali guariscono lungo il sito di incisione e continuano a fornire gameti per diversi mesi. </li><li> Raccogliere testicoli in una provetta Eppendorf da 1,5 ml con il minor SW possibile e conservare in ghiaccio fino al momento dell&#39;uso. Memorizzare qualsiasi testicoli non cied il giorno della raccolta a 4 ° C per un massimo di una settimana. </li><li> Raccogliere ovaie in un piccolo piatto di coltura di vetro in diversi millilitri di SW. Per rilasciare gli ovociti dal tessuto ovario, prendere in giro a parte il tessuto con due paia di pinze finché non rimangono pezzi di grandi dimensioni. NOTA: In modo ottimale, la maggior parte degli ovociti sono completamente sviluppati. Tali ovociti sono grandi, rotondi, e chiaro marrone giallo o chiaro con una vescicola germinale distinta nell&#39;ovocita (Figura 2A), rispetto al sottoinsieme di ovociti non sviluppati che sono più piccoli, marrone, granulosa, e opaco (Figura 2B). Se è maggiore di circa il 25% degli ovociti sono della varietà sviluppata, selezionare una femmina diversa per ottenere ovociti. </li><li> Versare gli ovociti e tessuto rimanente attraverso una tazza filtro in maglia con dimensione dei pori di 200 micron e raccogliere il flusso attraverso. Questo conterrà tutte le varietà di ovociti, ma rimuovere il tessuto ovarico. Sloggiare rimanenti ovociti dal tessuto catturati dal filtro a spruzzo wesima SW da una bottiglia a zampillo. Filtrare tazze sono realizzati con un tubo da 50 ml (Figura 3A-A &#39;). </li><li> Versare il flusso attraverso dal passaggio 1.6 attraverso un 100 micron tazza filtro a rete. Eliminare piccoli ovociti in flusso attraverso. Grandi ovociti pienamente sviluppati che sono pronti per la maturazione rimarrà sul filtro. Risciacquare gli ovociti in un bicchiere pulito 200 ml. </li><li> Aggiungere 95 ml di SW per il bicchiere di vetro 200 ml di ovociti. Aggiungere 5 ml di 200 mM 1-metiladenina per una concentrazione finale di 10 mM. </li><li> Trasferire gli ovociti ad un grande piatto di cultura superficiale e posto a 15 ° C. Una zona ad alta superficie piatto cultura del volume consente lo scambio di ossigeno. Gli ovociti non maturi o non possono sviluppare bene se sono sovraffollate durante questa fase di maturazione. Suddiviso in diversi piatti di SW oltre 10 mM 1-methlyadenine fino a quando la cultura è inferiore a 200 ovociti / ml. </li><li> Lasciare gli ovociti a maturare per 45-90 minuti, ma non più come questo renderà gli ovociti in grado di essere fertilized. Per determinare se la maturazione è completa, guardare gli ovociti in un ambito dissezione. Le vescicole germinali si muove verso e fonde con la membrana cellulare durante la maturazione. E poi si rompe e quindi non è più visibile in ovociti maturi (Figura 2C). </li></ol> 2 Concimazione di ovociti maturi <ol><li> Ha scelto un piccolo gruppo di tessuto testicolare, circa pisello, e tritare in un piccolo piatto di coltura in vetro con circa 1 ml di SW. </li><li> Utilizzare una pipetta Pasteur per trasferire 2-3 gocce di acqua di mare lattiginoso risultante a circa 100 ml di ovociti maturi e agitare il piatto cultura per mescolare. Evitare il trasferimento di pezzi di tessuto testicolare. Evitare l&#39;aggiunta di maggiori quantità di sperma in quanto ciò potrebbe causare polispermia e successivo sviluppo poveri. </li><li> Dopo alcuni minuti di osservare gli ovociti in un ambito dissezione. Uova fecondate, o zigoti, hanno una busta di fecondazione, che è una cupola trasparente che si alza dal cell membrana (Figura 2D). NOTA: Non procedere con la cultura, se inferiore al circa il 90% di uova fertilizzare in quanto i tassi di fecondazione poveri sono un&#39;indicazione di una cultura malsana che non può anche svilupparsi bene. </li><li> Dopo la fecondazione è completata, cambiare il SW sulle zigoti versando attraverso un filtro a maglia 100 micron e risciacquo in un piatto di cultura con SW fresca. E &#39;importante rimuovere lo sperma in eccesso per evitare carenza di ossigeno. Posizionare il piatto di coltura a 15 ° C per 15-30 min. </li></ol> 3 De-gelificante e Rowing fertilizzato le uova <ol><li> Preparare piatti iniezione prendendo il coperchio da una piastra di Petri di 60 x 15 mm in polistirene. <ol><li> Tracciare una linea di pennarello indelebile sul retro del piatto, intorno alla zona che corrisponde al campo visivo del microscopio microiniezione. Questo assicura che tutti gli embrioni filari sono all&#39;interno del campo di vista del microscopio. </li><li> Utilizzare una pipetta Pasteur di vetro a segnare una linea attraverso il cerchio, preferably su un lato del cerchio (Figura 3B). Utilizzare questa linea in seguito a rompere aghi da iniezione (punto 4.5). NOTA: I reagenti comunemente utilizzati per aderire embrioni di riccio di mare, ad esempio, protamina solfato o poli-L Lisina, sono inutili. De-gelatina P. zigoti miniata aderiscono molto bene alla plastica non patinata. Si noti che non si attacchino bene a piatti di vetro. </li></ol></li><li> Aggiungere circa 10 ml SW per ogni piatto in modo che la superficie è coperta, ma l&#39;acqua non schizzare troppo nel piatto in quanto ciò potrebbe turbare gli embrioni filari più. </li><li> Rimuovere il P. miniata cappotto gelatina zigote con SW acido prima di canottaggio. Questo cappotto gelatina è più ampio di quello osservato per le specie di riccio di mare modello. <ol><li> Preparare acido SW nel range di pH 4,0-4,2. Il pH è fondamentale per consentire la rimozione efficace del cappotto gelatina pur permettendo il normale sviluppo. </li><li> Aggiungere singole gocce di 1 N (1 M) HCl in SW di un 1 L stock di SW. Consentire ad ogni goccia per mescolare completamentee monitorare il pH prima di aggiungere altro HCl. NOTA: Uno a diversi ml di HCl risultati del pH del caso, ma non aggiungere l&#39;intero volume in una sola volta. NOTA: Preparare 1 N HCl in cappa con SW e 12 N (12 M) HCl. </li><li> Rimuovere SW su zigoti da loro versando su un filtro a maglia 100 micron. Risciacquare in un becher da 200 ml nella più piccola quantità di SW possibile (circa 10 ml). Riempire il bicchiere fino a 150 ml con SW acido (pH 4.0) e consentire gli zigoti di sedersi nel SW acido per 3 min. </li></ol></li><li> Striscia gelatina cappotto dalle zigoti versando avanti e indietro tra due bicchieri da 200 ml, ogni volta che passa gli zigoti attraverso un filtro a maglie di 200 micron. Versare gli zigoti attraverso il filtro intorno 5-10x sopra su una finestra di tempo 2 min. </li><li> Rimuovere SW acido versando gli zigoti su un filtro a maglia 100 micron. Sciacquare gli zigoti in un piccolo piatto di coltura di vetro con SW. De-zigoti in gelatina possono attenersi a piatti di plastica. Embrioni immediatamente Row; cominciano a produrre più jelly cappotto che porta a scarsa adesione ai piatti di plastica nel tempo. </li><li> Utilizzare una pipetta a bocca (Figura 3C-C &#39;) per prendere zigoti dalla cultura piatto di vetro e metterli in linee rette sulle stoviglie di iniezione. Sciogliere il centro del lato sottile di una pipetta Pasteur a fuoco finché il vetro è morbido. Rapidamente tirare le estremità del vetro a parte per produrre un sottile tratto di vetro. Una volta che il vetro è freddo, rompere la piccola estremità della pipetta Pasteur (per ulteriori informazioni sulla preparazione di una pipetta a bocca vedere Wessel et al., 2004 17 o Dolce et al., 2004 18). <ol><li> Effettuare una pipetta remi tale che il diametro è appena superiore al diametro degli embrioni in modo che solo un singolo zigote sarà entrare ed uscire dalla pipetta alla volta. Ciò consentirà una singola riga per formare. Piccole pipette di diametro possono togliere la busta fecondazione e disturbare gli zigoti come P. zigoti miniata non hanno una membrana ialina unnd sono abbastanza morbido. </li><li> Se gli zigoti non si attacchino al piatto di plastica, li conserva per più tempo a SW acido (fino a diversi minuti). In alternativa, una pipetta di diametro inferiore può essere di aiuto nella rimozione cappotto gelatina per consentire gli zigoti per attaccare in modo più efficace. </li><li> Gli zigoti sono leggermente assetto positivo e tendono a galleggiare o soffermarsi appena sopra il fondo del piatto. In questo caso, posizionare la pipetta remi modo che gli zigoti pigiate delicatamente sulla superficie del piatto che escono dalla pipetta (Figura 3D). NOTA:. E &#39;possibile montare in molte righe su questi piatti P. membrane embrionali miniata non diventano più difficili da penetrare nel tempo e quindi si può iniettare centinaia di zigoti su un singolo piatto. </li></ol></li></ol> 4 Iniezione di zigoti <ol><li> Preparare le soluzioni di iniezione con adeguate concentrazioni di oligonucleotidi antisenso morfolino (MASO), mRNA, o DNA in una conc finaleentration di KCl 200 mM. 400-800 micron MASO e 2,5 ng / ml di DNA tendono a produrre fenotipi morphant riducendo al minimo la tossicità. La concentrazione finale l&#39;uovo sarà 1/125 ° della concentrazione di partenza 14. Per soluzioni contenenti iniezione MASOS, calore a 65 ° C per 5 min immediatamente prima dell&#39;uso e quindi memorizzare a temperatura ambiente. <ol><li> Per facilità di classificare gli embrioni iniettati, aggiungere rodamina destrano tracciante alla soluzione iniettabile per ottenere una concentrazione di 0,1%. </li></ol></li><li> Preparare aghi da iniezione tirando tubo capillare di vetro (1,0 millimetri OD ID x 0,75 mm, 100 mm di lunghezza) in un ago di trazione strumento seguendo le istruzioni del produttore. Aghi adatti per l&#39;iniezione di ricci di mare anche funzionare bene per le stelle di mare, in modo da utilizzare parametri simili 19. </li><li> Caricare circa 2 ml di soluzione iniettabile in un ago per iniezione con una punta microloader pipetta. </li><li> Inserire l&#39;estremità smussata dell&#39;ago nel manipulator. Impostare picospritzer a 100 impulsi msec e una pressione d&#39;aria di 40 PSI. </li><li> Posizionare un piatto di embrioni filari sul palco microscopio e hanno tutti gli embrioni nel campo visivo. Orientate il piatto in modo che la linea è segnato sul lato più vicino all&#39;ago. Posizionare l&#39;ago con un angolo di circa 60 ° in modo che la punta si trova vicino al centro della linea e appena sopra la superficie dell&#39;acqua. </li><li> Focus sulla linea segnata e abbassare l&#39;ago fino a quando la punta è a fuoco. Abbassare la punta un po &#39;di più e rompere aperto eseguendo delicatamente nelle creste della linea segnata. Sollevare la punta dalla superficie del piatto e posizionarlo nella parte superiore della prima riga di zigoti e concentrarsi sulle zigoti. </li><li> Abbassare la punta in modo che questo impalare il centro di zigote provenienti da circa un angolo di 60 °. L&#39;ago penetra facilmente P. zigoti miniata. Passo sul pedale (o altri mezzi di forzatura materiale dal ago per iniezione) per introdurre un bolo di Injesoluzione ction in embrione. </li><li> Obiettivo per un bolo che è del 20-30% del diametro dell&#39;embrione, o tra 25 e 80 pl. Se il bolo è più grande o più piccolo di questo, regolare la durata dell&#39;iniezione sul picospritzer e iniettare il prossimo embrione. Continuare a regolare la durata per ottenere la dimensione del bolo desiderata. Inizia a 100 msec durata. Re-rompere l&#39;ago se maggiore di circa 200 msec è necessario per introdurre il bolo appropriato. Gettare l&#39;ago e preparare una nuova se è necessaria meno di 15-20 msec per ottenere queste dimensioni bolo come la dimensione dell&#39;ago è troppo grande e può disturbare il normale sviluppo. </li><li> Procedere per iniettare i restanti zigoti sul piatto di iniezione. Gli embrioni possono facilmente essere iniettato fino a quando inizia la scissione e in singoli blastomeri dopo la prima scissione. Periodicamente sollevare l&#39;ago sopra la superficie dell&#39;acqua per rimuovere zigoti che sporgono sull&#39;ago. Se necessario ri-rompere la punta dell&#39;ago o caricare un nuovo ago se si verifica un blocco. </li></ol><ol><li> Lasciare gli embrioni si sviluppano a 15 ° C a SW. Mantenere elevata superficie e il volume nelle colture per consentire lo scambio di ossigeno. Assicurarsi che gli embrioni non sono affollate; tenere culture pari o inferiore a 200 embrioni / ml. A seconda della fase desiderata embrionale, prevede di raccogliere embrioni iniettati in circa 20-24 ore dopo la fecondazione. NOTA: Questo è spesso il momento ideale per ordinare e raccogliere e perché normalmente gli embrioni in via di sviluppo sono facilmente distinguibili morfologicamente, ma non sono ancora nuoto. </li><li> Se gli embrioni sono nati, salateli leggermente scossa per evitare il nuoto. Aggiungere 200 ml di NaCl 5 M a 10 ml di SW nel piatto iniezione mentre delicatamente roteare il SW. Dopo pochi minuti, gli embrioni cadranno al fondo del piatto. Raccogliere questi e spostarli alla normalità SW salinità. </li><li> Raccogliere embrioni iniettati sotto una sorgente luminosa fluorescente appropriato compatibile con il tracciante utilizzato nella injectisulla soluzione. Se non è stato utilizzato alcun tracciante, sorta di selezionare gli embrioni per la morfologia normale. </li><li> Usando una pipetta a bocca, disegnare fluorescente embrioni con una quantità minima di SW e soffiare fuori in un piccolo piatto pieno di cultura SW. Pipette bocca ideali hanno una grande apertura sufficiente per gli embrioni di essere tirato dentro e fuori senza danneggiarli, ma non così grande che gli embrioni indesiderati e SW estranei sono anche tirato su. </li><li> Una volta che tutti gli embrioni desiderati sono stati raccolti nel nuovo piatto, osservare gli embrioni sotto la luce fluorescente e rimuovere eventuali embrioni non-iniettato o embrioni poco sviluppati. </li><li> Cultura allineati embrioni a stadi desiderati in un incubatore e procedere con l&#39;imaging o altri protocolli desiderati. </li></ol>

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Nessun conflitto di interessi dichiarati dagli autori.

Ci sono due passaggi critici che sono difficili per gli utenti meno esperti di questa tecnica, ma sono essenziali per la creazione di embrioni con successo morphant. La prima è la selezione ovociti sani che matureranno e fertilizzare correttamente. La percentuale di sviluppo normale in una cultura dipende dalla stagione, la salute dell&#39;animale, e il numero di volte che gli ovociti sono stati raccolti da un singolo individuo. Gli oociti tendono ad essere di qualità migliore da aprile a ottobre. E &#39;importante gu...

La stella di mare, Patiria miniata, (comunemente noto come la stella pipistrello) sta emergendo come un interessante e versatile sistema modello per una varietà di cellulare da 1 a 3, dello sviluppo 4,5, evolutiva 6- 8, e studi ecologici 9- 11. Adult P. miniata sono distribuiti lungo la costa del Pacifico da Sitka, in Alaska a Baja, California 12 e sono facilmente mantenuti in acquari marini. Gli ovociti sono tutto l&#39;anno ottenibili e ogni femmina può gettare decine di migliaia di uova. Gli ovociti sono facilmente maturati e fecondati esternamente 13. Gli embrioni risultanti sono trasparenti consentendo una facile osservazione; si sviluppano in modo sincrono, e richiedono solo acqua di mare per lo sviluppo. Assemblaggio del genoma intero e più trascrittomi sono disponibili anche P. miniata ( <a href="http://www.echinobase.org/Echinobase/">Echinobase.org</a> ). Tali vantaggi li rendono ideali per una gamma di ricercae scopi didattici. Negli ultimi anni, P. miniata è diventato un sistema modello per gene dello sviluppo della rete di regolamentazione analizza 14- 16. Lo scopo di questi studi è quello di identificare l&#39;intero complimento di geni regolatori e determinare la rete delle loro interazioni. Molto di questo lavoro comporta l&#39;espressione genica perturbante attraverso l&#39;introduzione di oligonucleotidi antisenso o in mRNA sintetizzato in vitro. Inoltre, le analisi normative cis sono utilizzati per caratterizzare la funzione del DNA di regolamentazione 15. Queste analisi richiedono l&#39;introduzione di reagenti perturbazione e / o giornalista DNA costrutti in embrioni. Inoltre, per caratterizzare gli effetti a valle di tali perturbazioni, si deve eseguire il test di molti embrioni per cambiamenti nell&#39;espressione genica di potenziali bersagli. Tecniche di microiniezione di molte centinaia di zigoti sono centrali per questo lavoro. Echinodermi, tra cui P. miniata </em&gt;, richiedono molti mesi per raggiungere la maturità sessuale. A causa di questo, generalmente non è pratico per sviluppare e mantenere linee transgeniche di questi animali per la sperimentazione. Pertanto, l&#39;allevamento di adulti transgenici non può in modo efficiente creare embrioni modificati. Invece, perturbazione deve avvenire de novo attraverso la microiniezione. Microiniezione offre l&#39;opportunità di modificare gli embrioni con reagenti che non sono cellula-permeabili. Il seguente protocollo descrive un metodo per introdurre il DNA, mRNA, traccianti cellulari, e oligonucleotidi antisenso morfolino in centinaia di uova fecondate in un 2-3 ore seduto attraverso microiniezione. Questo produce materiale sufficiente per una serie di esperimenti a valle tra cui, ma non limitato a, qPCR, ibridazione in situ, RNA-Seq, e western blotting.

<table><tbody><tr><td>1-Methyladenine</td><td>Acros Organics (Fisher Scientific)</td><td>AC20131-1000</td><td></td></tr><tr><td>190 micron nitex nylon filter</td><td>Small Parts (originally Sefar)</td><td>CMN-0185-C/5PK-05</td><td></td></tr><tr><td>100 micron nitex nylon filter</td><td>Small Parts (originally Sefar)</td><td>CMN-0105-C/5PK-05</td><td></td></tr><tr><td>Polystyrene Petri dishes, 60 mm x 15 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875713A</td><td></td></tr><tr><td>Capillary tubing</td><td>FHC, Inc</td><td>30-30-0</td><td>For pulling microinjection needles</td></tr><tr><td>Model P-97 Needle Puller</td><td>Sutter Instruments</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Dextran, Rhodamine Green</td><td>Life Technologies</td><td>D7163</td><td>If injecting a GFP expression reporter, it is helpful to substitute Texas Red dextran as an injection tracer</td></tr><tr><td>Instant Ocean Sea Salt</td><td>Doctors Foster and Smith</td><td>CD-116528</td><td>Also available in many pet stores</td></tr><tr><td>Microloader tips</td><td>Eppendorf</td><td>5242 956.003</td><td></td></tr></tbody></table>

a method for microinjection of patiria minata zygotes

Echinodermi sono stati a lungo un sistema modello preferito per gli studi di riproduzione e sviluppo, e più recentemente per lo studio della regolazione genica e di evoluzione dei processi di sviluppo. La stella di mare, Patiria miniata, sta guadagnando prevalenza come sistema modello per questo tipo di studi, che in precedenza erano svolte quasi esclusivamente nei ricci di mare, Strongylocentrotus purpuratus e Lytechinus variegatus. Un vantaggio di questi sistemi modello è la facilità di produzione di embrioni modificati in cui un particolare gene è attivo o inibiti, etichettare un gruppo di celle, o introdurre un gene reporter. Un metodo microiniezione unico è in grado di creare un&#39;ampia varietà di tali embrioni modificati. Qui, vi presentiamo un metodo per ottenere gameti da P. miniata, producendo zigoti, e l&#39;introduzione di reagenti perturbanti tramite microiniezione. Embrioni sani morphant sono successivamente isolati per studi quantitativi e qualitativi di gefunzione ne. La disponibilità di genoma e trascrittoma dati di questo organismo ha aumentato i tipi di studi che vengono eseguite e la facilità di loro esecuzione.

L&#39;obiettivo di questo protocollo è quello di introdurre i reagenti in embrioni. Dimostriamo l&#39;efficacia del protocollo iniettando un giornalista costrutto di DNA che guida l&#39;espressione della proteina fluorescente verde (GFP). Embrioni iniettati esprimono GFP a chiazze clonali (Figura 4A-B) in quanto incorpora il DNA durante la prima scissione. Molti reagenti che sono auspicabile introdurre in embrioni sono tossici in quantità elevate e per lotti non ottimali di embrioni. Manifesti di toss...

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A Method for Microinjection of Patiria minata Zygotes

I metodi che producono embrioni morphant sono essenziali per studiare i meccanismi di sviluppo e reti di regolazione genica. La stella di mare Patiria miniata è un sistema modello emergente per questi studi. Qui vi presentiamo un protocollo per l&#39;ottenimento di gameti, la produzione di colture di embrioni, e la rapida microiniezione di zigoti di questa specie.

Un metodo per la microiniezione di<em&gt; Patiria minata</em&gt; zigoti

Echinoderms have long been a favorite model system for studies of reproduction and development, and more recently for the study of gene regulation and ...

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Research

JoVE Journal

Biology

A Method for Microinjection of Patiria minata Zygotes

10.9K Views.  Carnegie Mellon University.  I metodi che producono embrioni morphant sono essenziali per studiare i meccanismi di sviluppo e reti di regolazione genica. La stella di mare Patiria miniata è un sistema modello emergente per questi studi. Qui vi presentiamo un protocollo per l'ottenimento di gameti, la produzione di colture di embrioni, e la rapida microiniezione di zigoti di questa specie. 

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Laser-assisted Cytoplasmic Microinjection in Livestock Zygotes

Cytoplasmic microinjection into one-cell embryos is a very powerful technique. As an example, it enables the delivery of genome editing tools that can create genetic modifications that will be present in every cell of an adult organism. It can also be used to deliver siRNA, mRNAs or blocking antibodies to study gene function in preimplantation embryos. The conventional technique for microinjecting embryos used in rodents consists of a very thin micropipette that directly penetrates the plasma membrane when advanced into the embryo. When this technique is applied to livestock animals it usually results in low efficiency. This is mainly because in contrast to mice and rats, bovine, ovine, and porcine zygotes have a very dark cytoplasm and a highly elastic plasma membrane that makes visualization during injection and penetration of the plasma membrane hard to achieve. In this protocol, we describe a suitable microinjection method for the delivery of solutions into the cytoplasm of cattle zygotes that has proved to be successful for sheep and pig embryos as well. First, a laser is used to create a hole in the zona pellucida. Then a blunt-end glass micropipette is introduced through the hole and advanced until the tip of the needle reaches about 3/4 into the embryo. Then, the plasma membrane is broken by aspiration of cytoplasmic content inside the needle. Finally, the aspirated cytoplasmic content followed by the solution of interest is injected back into the embryonic cytoplasm. This protocol has been successfully used for the delivery of different solutions into bovine and ovine zygotes with 100% efficiency, minimal lysis, and normal blastocysts development rates.

This protocol shows how to perform cytoplasmic microinjection in farm animal zygotes. This technique can be used to deliver any solution into the one-cell embryo such as genome editing tools to generate knockout animals.

Laser-assistita citoplasmatica microiniezione nel bestiame zigoti

Cytoplasmic microinjection into one-cell embryos is a very powerful technique. As an example, it enables the delivery of genome editing tools that can ...

Ricerca

Genetica

Analysis of Zebrafish Kidney Development with Time-lapse Imaging Using a Dissecting Microscope Equipped for Optical Sectioning

In order to understand organogenesis, the spatial and temporal alterations that occur during development of tissues need to be recorded. The method described here allows time-lapse analysis of normal and impaired kidney development in zebrafish embryos by using a fluorescence dissecting microscope equipped for structured illumination and z-stack acquisition. To visualize nephrogenesis, transgenic zebrafish (Tg(wt1b:GFP)) with fluorescently labeled kidney structures were used. Renal defects were triggered by injection of an antisense morpholino oligonucleotide against the Wilms tumor gene wt1a, a factor known to be crucial for kidney development.
The advantage of the experimental setup is the combination of a zoom microscope with simple strategies for re-adjusting movements in x, y or z direction without additional equipment. To circumvent focal drift that is induced by temperature variations and mechanical vibrations, an autofocus strategy was applied instead of utilizing a usually required environmental chamber. In order to re-adjust the positional changes due to a xy-drift, imaging chambers with imprinted relocation grids were employed.
In comparison to more complex setups for time-lapse recording with optical sectioning such as confocal laser scanning&#160;or light sheet microscopes, a zoom microscope is easy to handle. Besides, it offers dissecting microscope-specific benefits such as high depth of field and an extended working distance.
The method to study organogenesis presented here can also be used with fluorescence stereo microscopes not capable of optical sectioning. Although limited for high-throughput, this technique offers an alternative to more complex equipment that is normally used for time-lapse recording of developing tissues and organ dynamics.

The method described here allows time-lapse analysis of organ development in zebrafish embryos by using a fluorescence dissecting microscope capable of performing optical sectioning and simple strategies of readjustment to correct focal and planar drift.

Analisi dello sviluppo del rene Zebrafish con time-lapse imaging Utilizzando una dissezione microscopio dotato di sezionamento ottico

In order to understand organogenesis, the spatial and temporal alterations that occur during development of tissues need to be recorded. The method ...

Biologia dello sviluppo

Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos.

An essential tool for investigating the role of a gene during development is the ability to perform gene knockdown, overexpression, and misexpression studies. In zebrafish (Danio rerio), microinjection of RNA, DNA, proteins, antisense oligonucleotides and other small molecules into the developing embryo provides researchers a quick and robust assay for exploring gene function in vivo. In this video-article, we will demonstrate how to prepare and microinject in vitro synthesized EGFP mRNA and a translational-blocking morpholino oligo against pkd2, a gene associated with autosomal dominant polycystic kidney disease (ADPKD), into 1-cell stage zebrafish embryos. We will then analyze the success of the mRNA and morpholino microinjections by verifying GFP expression and phenotype analysis. Broad applications of this technique include generating transgenic animals and germ-line chimeras, cell-fate mapping and gene screening. Herein we describe a protocol for overexpression of EGFP and knockdown of pkd2 by mRNA and morpholino oligonucleotide injection.

Microinjection is a well-established and effective method for introducing foreign substances into fertilized zebrafish embryos. Here, we demonstrate a robust microinjection technique for performing mRNA overexpression, and morpholino oligonucleotide gene knockdown studies in zebrafish.

Microiniezione di mRNA e oligonucleotidi antisenso Morpholino in embrioni di zebrafish.

An essential tool for investigating the role of a gene during development is the ability to perform gene knockdown, overexpression, and misexpression ...

Biologia

Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic oligonucleotides with antisense complementarity to target RNAs, can be added to the embryo to reduce the expression of a particular gene product.  Conversely, processed mRNA can be added to the embryo to increase levels of a gene product.  The vehicle for adding either mRNA or morpholino to an embryo is microinjection.  Microinjection is efficient and rapid, allowing for the injection of hundreds of embryos per hour.  This video shows all the steps involved in microinjection.  Briefly, eggs are collected immediately after being laid and lined up against a microscope slide in a Petri dish.  Next, a fine-tipped needle loaded with injection material is connected to a microinjector and an air source, and the microinjector controls are adjusted to produce a desirable injection volume.  Finally, the needle is plunged into the embryo's yolk and the morpholino or mRNA is expelled.

This video shows how morpholino or mRNA can be injected into zebrafish embryos at the one-cell stage to decrease or increase the level of specific gene products during subsequent development.

Microiniezione di embrioni di zebrafish per analizzare la funzione del gene

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic ...

Microstructured Devices for Optimized Microinjection and Imaging of Zebrafish Larvae

Zebrafish have emerged as a powerful model of various human diseases and a useful tool for an increasing range of experimental studies, spanning fundamental developmental biology through to large-scale genetic and chemical screens. However, many experiments, especially those related to infection and xenograft models, rely on microinjection and imaging of embryos and larvae, which are laborious techniques that require skill and expertise. To improve the precision and throughput of current microinjection techniques, we developed a series of microstructured devices to orient and stabilize zebrafish embryos at 2 days post fertilization (dpf) in ventral, dorsal, or lateral orientation prior to the procedure. To aid in the imaging of embryos, we also designed a simple device with channels that orient 4 zebrafish laterally in parallel against a glass cover slip. Together, the tools that we present here demonstrate the effectiveness of photolithographic approaches to generate useful devices for the optimization of zebrafish techniques.

Microinjection of zebrafish embryos and larvae is a crucial but challenging technique used in many zebrafish models. Here, we present a range of microscale tools to aid in the stabilization and orientation of zebrafish for both microinjection and imaging.

Dispositivi microstrutturati Microinjection ottimizzata e Imaging delle larve di Zebrafish

Zebrafish have emerged as a powerful model of various human diseases and a useful tool for an increasing range of experimental studies, spanning ...

Microinjection Method for Anopheles gambiae Embryos

Embryo microinjection techniques are essential for many molecular and genetic studies of insect species. They provide a means to introduce exogenous DNA fragments encoding genes of interest as well as favorable traits into the insect germline in a stable and heritable manner. The resulting transgenic strains can be studied for phenotypic changes resulting from the expression of the integrated DNA to answer basic questions or used in practical applications. Although the technology is straightforward, it requires of the investigator patience and practice to achieve a level of skill that maximizes efficiency. Shown here is a method for microinjection of embryos of the African malaria mosquito, Anopheles gambiae. The objective is to deliver by microinjection exogenous DNA to the embryo so that it can be taken up in the developing germline (pole) cells. Expression from the injected DNA of transposases, integrases, recombinases, or other nucleases (for example CRISPR-associated proteins, Cas) can trigger events that lead to its covalent insertion into chromosomes. Transgenic An. gambiae generated from these technologies have been used for basic studies of immune system components, genes involved in blood-feeding, and elements of the olfactory system. In addition, these techniques have been used to produce An. gambiae strains with traits that may help control the transmission of malaria parasites.

Microinjection Method for Anopheles gambiae Embryos

Microinjection techniques are essential to introduce exogenous genes into the genomes of mosquitoes. This protocol explains a method used by the James laboratory to microinject DNA constructs into Anopheles gambiae embryos to generate transformed mosquitoes.

Metodo di microiniezione per embrioni di Anopheles gambiae

Embryo microinjection techniques are essential for many molecular and genetic studies of insect species. They provide a means to introduce exogenous DNA ...

Microinjection of Medaka Embryos for use as a Model Genetic Organism

In this video, we demonstrate the technique of microinjection into one-cell stage medaka embryos. Medaka is a small egg-laying freshwater fish that allows both genetic and embryological analyses and is one of the vertebrate model organisms in which genome-wide phenotype-driven mutant screens were carried out 1, as in zebrafish and the mouse. Divergence of functional overlap of related genes between medaka and zebrafish allows identification of novel phenotypes that are unidentifiable in a single species 2, thus medaka and zebrafish are complementary for genetic dissection of vertebrate genome functions.
To take advantage of medaka fish whose embryos are transparent and develop externally, microinjection is an essential technique to inject cell-tracers for labeling cells, mRNAs or anti-sense oligonucleotides for over-expressing and knocking-down genes of interest, and DNAs for making transgenic lines.

Medaka and zebrafish are complementary for genetic dissection of vertebrate genome functions. This protocol highlights the key points for successful microinjection into medaka embryos, an important technique for embryological and genetic analysis using medaka and zebrafish in a laboratory.

Microiniezione di embrioni Medaka per essere utilizzato come organismo modello genetico

In this video, we demonstrate the technique of microinjection into one-cell stage medaka embryos. Medaka is a small egg-laying freshwater fish that allows ...

Zygote Microinjection for Creating Gene Cassette Knock-in and Flox Alleles in Mice

CRISPR-Cas technology has enabled the rapid and effortless generation of genetically modified mice. Specifically, mice and point mutant mice are readily produced by electroporation of CRISPR factors (and single-stranded oligo DNA donors) into the zygote. In contrast, gene cassette (&#62;1 kb) knock-in and floxed mice are mainly generated by microinjection of CRISPR factors and double-stranded DNA donors into zygotes. Genome editing technologies have also increased the flexibility of genetically modified mice production. It is now possible to introduce the intended mutations in the target genomic regions in a number of beneficial inbred mouse strains. Our team has produced over 200 gene cassette knock-in mouse lines, and over 110 floxed mouse lines by zygote microinjection of CRISPR-Cas9 following requests from several countries, including Japan. Some of these genome editing used BALB/c, C3H/HeJ, and C57BL/6N inbred strains, however most used C57BL/6J. Unlike the electroporation method, genome editing by zygote microinjection in various inbred strains of mice is not that easy. However, gene cassette knock-in and floxed mice on single inbred genetic backgrounds are as critical as genetic humanized, fluorescent reporter, and conditional knockout mouse models. Therefore, this article presents the protocol for the zygote microinjection of CRISPR factors and double-stranded DNA donors in C57BL/6J mice for generating gene cassette knock-in and floxed mice. This article exclusively focuses on nuclear injection rather than cytoplasmic injection. In addition to zygote microinjection, we outline the timeline for the production process and peripheral techniques such as induction of superovulation and embryo transfer.

The present protocol describes zygote microinjection of CRISPR-Cas9 and donor DNA to efficiently produce gene cassette knock-in and floxed mice.

Microiniezione di zigote per la creazione di alleli knock-in e flox a cassetta genica nei topi

CRISPR-Cas technology has enabled the rapid and effortless generation of genetically modified mice. Specifically, mice and point mutant mice are readily ...

High Throughput Microinjections of Sea Urchin Zygotes

Microinjection into cells and embryos is a common technique that is used to study a wide range of biological processes. In this method a small amount of treatment solution is loaded into a microinjection needle that is used to physically inject individual immobilized cells or embryos. Despite the need for initial training to perform this procedure for high-throughput delivery, microinjection offers maximum efficiency and reproducible delivery of a wide variety of treatment solutions (including complex mixtures of samples) into cells, eggs or embryos. Applications to microinjections include delivery of DNA constructs, mRNAs, recombinant proteins, gain of function, and loss of function reagents. Fluorescent or colorimetric dye is added to the injected solution to enable instant visualization of efficient delivery as well as a tool for reliable normalization of the amount of the delivered solution. The described method enables microinjection of 100-400 sea urchin zygotes within 10-15 min.

Microinjection is a common technique used to deliver DNA constructs, mRNAs, morpholino antisense oligonucleotides or other treatments into eggs, embryos, and cells of various species.

High Throughput microiniezioni di Sea Urchin zigoti

Microinjection into cells and embryos is a common technique that is used to study a wide range of biological processes. In this method a small amount of ...

Zebrafish Microinjection Techniques

One of the major advantages to working with zebrafish (Danio rerio) is that their genetics can be easily manipulated by microinjection of early stage embryos. Using this technique, solutions containing genetic material or knockdown constructs are delivered into the blastomeres: the embryonic cells sitting atop the yolk of the newly fertilized egg. Delivery into the cytoplasm is achieved either through direct injection into the blastomere, or via natural cytoplasmic movements that occur after a solution is injected into the yolk. Successful genetic manipulations are usually followed by quantification of embryonic phenotypes in order to elucidate the genetic mechanisms of development.
This video will provide an introduction to carrying out microinjections in zebrafish embryos. The discussion begins with a review of the essential tools for the technique, including the injection apparatus and the microinjector, which controls fluid movement with pressure pulses of air. Next, important preparatory steps are demonstrated, such as the pouring of agar plates to stabilize embryos during injection and calibration of the microinjection apparatus. The injection procedure is then presented along with tips on when and where injections should be performed. Finally, applications of the microinjection technique are discussed, including gene overexpression via mRNA injection, gene silencing by delivery of antisense morpholino oligonucleotides, and the generation of transgenic zebrafish using specially engineered plasmid DNA.

Introduction to Microinjection of Early Zebrafish Embryos

Tecniche di microiniezione di Zebrafish

One of the major advantages to working with zebrafish (Danio rerio) is that their genetics can be easily manipulated by microinjection of early stage ...

Un metodo per la microiniezione di

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