We wish to thank Peter Munro PhD for his assistance with optic nerve sectioning. This study was supported by the Medical Research Council (G0901303), and in part by the Dorothy Hodgkin Postgraduate Award/Medical Research Council, the Helen Hamlyn Trust, Fight for Sight, and Moorfields special trustess,.

Déclaration éthique: Toutes les expériences animales ont été menées en conformité avec le Comité soin et l&#39;utilisation institutionnelle des animaux (IACUC), et ont été approuvés en accord avec les lignes directrices Royaume-Uni du Home Office ( <a href="http://goo.gl/FLkirW" target="_blank">http://goo.gl/FLkirW</a> , dernier accès 10 ème Juin , 2014) et la Déclaration ARVO pour l&#39;utilisation d&#39;animaux dans ophtalmique et Vision Research ( <a href="http://goo.gl/4LFOjD" target="_blank">http://goo.gl/4LFOjD</a> , dernier accès 10 ème Juin, 2014). 1. hypertension oculaire induction <ol><li> Provoquer le glaucome expérimental par élévation de la pression intra-oculaire (PIO) par injection unilatérale de microsphères paramagnétiques dans la chambre antérieure de rats Brown Norway, basée sur la méthode de Samsel et al. 3 autres rats pigmentés peuvent convenir, mais ceux-ci devront être validé d&#39;abord par l&#39;utilisateur. </li><li> Maison 250-300 g femmerats ex-éleveur Brown Norway dans un environnement de faible luminosité constante (40-60 lux) pour minimiser les fluctuations de la PIO diurne 7, avec accès à la nourriture et de l&#39;eau ad libitum. </li><li> Prendre des mesures de la PIO de base chez les animaux éveillés 8 avant l&#39;anesthésie et l&#39;injection de billes, en utilisant un tonomètre à rebond calibré pour une utilisation dans l&#39;oeil de rat neuf. IOP est prise comme la moyenne de cinq mesures. </li><li> Anesthésier les rats avec 37,5 mg / kg de kétamine et 0,25 mg / kg de chlorhydrate de médétomidine délivré par voie intraperitoneale. Confirmez profondeur de l&#39;anesthésie en testant les réflexes des pieds arrière de l&#39;animal, avant l&#39;application d&#39;iode povidone (voir l&#39;étape 1.5), et l&#39;injection de talon (voir l&#39;étape 1.8). Administrer 0,5% de chlorhydrate de proparacaïne pour l&#39;analgésie. NOTE: Ne pas dilater la pupille à tout moment. Cela aidera les perles se déposer dans l&#39;angle irido-cornéen, et empêcher la fixation de l&#39;objectif. Appliquer une pommade oculaire pour éviter le dessèchement de la cornée sur l&#39;oeil controlatéral non opéré. </li><li> Wcendres l&#39;oeil opérationnelle avec 5% de povidone iode dans de l&#39;eau 10 5 min avant l&#39;injection. </li><li> Après 5 min, évacuer l&#39;iode povidone hors utilisant gaze stérile, et laver les yeux avec 0,9% de solution saline stérile. Gardez l&#39;œil humide pendant l&#39;anesthésie avec l&#39;application régulière de solution saline stérile. </li><li> Placez un aimant toroïdal autour de l&#39;œil. </li><li> Injecter 25 ul d&#39;une solution contenant 30 mg / ml de gamma-irradiation stérilisé 8 um microsphères magnétiques dans une solution saline équilibrée de Hank (HBSS) dans la chambre antérieure, à l&#39;aide d&#39;une aiguille biseautée 33 G. <ol><li> Pour préparer perles, laver à la re-suspension, puis centrifugation 3 fois à 10 000 g pendant 5 min avec 1 ml de HBSS, avant de faire le / solution finale de 30 mg ml. Maintenir des conditions stériles à travers. </li><li> Pour l&#39;injection, être prudent pour éviter d&#39;insérer l&#39;aiguille à l&#39;iris, afin de minimiser le risque de traumatisme iris. Ceci peut être évité en orientant l&#39;aiguille tangent à la surface de la cornée, comme parallèle àl&#39;iris que possible. Cela permettra également de minimiser la perte de perles à partir du site d&#39;injection. NOTE: Injecter perles à un rythme rapide pour assurer une distribution uniforme autour de l&#39;angle iridocornéen, qui est essentiel pour élever la PIO. De plus, des billes de magasin, les aiguilles et les anneaux magnétiques séparément de sorte que les billes ne forment pas des grappes, ce qui les rend difficiles à charger dans la seringue et l&#39;injection, et l&#39;aiguille ne devient pas magnétisée. </li></ol></li><li> Laissez l&#39;aiguille en place pendant 1 min après l&#39;injection pour se assurer que les perles se installent dans l&#39;angle iridocornéen à entraver le drainage aqueuse du trabéculum. Légèrement angle l&#39;aiguille après les perles ont d&#39;abord installés pour permettre une fuite d&#39;une solution aqueuse, de minimiser les augmentations transitoires de la PIO. A la fin de la chirurgie rincer l&#39;aiguille à travers la première avec du tampon phosphate salin (PBS), puis 70% d&#39;éthanol, puis de l&#39;eau distillée, afin d&#39;assurer l&#39;utilisation continue de l&#39;aiguille dans des procédures distinctes. Alternativement, on peut utiliseraiguilles jetables si la combinaison de la jauge et la seringue correcte est disponible. Facultatif: aiguilles peuvent être affûtées en utilisant un biseauteur de prolonger leur utilisation. </li><li> A ce stade, si nécessaire, retirer l&#39;aimant, et l&#39;utiliser pour en tirer des billes dans les zones de couverture incomplète. </li><li> Laissez l&#39;aimant en place autour de l&#39;œil pour une nouvelle post-injection de 10 min pour assurer perles se installent bien dans l&#39;angle iridocornéen. </li><li> Anesthésie inverse en utilisant 0,25 mg / kg de chlorhydrate atipemezole. </li><li> Administrer le chloramphénicol, ou autre pommade antibiotique, par exemple la gentamycine ou la terramycine par voie topique pour prévenir l&#39;infection, et le chlorhydrate de proparacaïne à 0,5% pour l&#39;analgésie. Laissez les animaux de récupérer sur un tapis de chaleur jusqu&#39;à ce qu&#39;ils reprennent le mouvement, puis transfert à une boîte chaude et d&#39;approvisionnement avec la nutrition supplémentaire, comme un complément alimentaire ou le régime alimentaire régulière imbibé jusqu&#39;à la guérison est complète. Analgésie systémique ou local doit être administré à des animaux présentant des signes de douleur 24 heures après la chirurgie. Si these symptômes persistent malgré le traitement, les animaux doivent être abattus sans cruauté. </li><li> Utilisez l&#39;oeil controlatéral comme un contrôle non opéré. </li><li> Effectuer des mesures de la PIO chaque 2-3 jours après l&#39;administration de talon, et par la suite tous les 2-3 jours en utilisant un tonomètre à rebond étalonné pour être utilisé dans l&#39;oeil de rat 9. </li><li> Les critères d&#39;inclusion des yeux dans les études peuvent être: 1) si la PIO est élevée au-dessus de la pression de commande controlatéral de 5 mmHg, et 2) ne dépasse pas 60 mmHg. </li><li> Yeux où la pression revient à la ligne de base (généralement en 1 semaine post-injection) ne devraient pas être inclus dans les études, cependant il est possible de réinjecter perles dans les yeux qui parviennent pas à développer une PIO élevée si désiré. </li><li> Euthanasier les animaux par asphyxie au CO2 à la fin de l&#39;expérience. </li><li> Disséquer les yeux et les nerfs optiques, et fixer paraformaldéhyde 4% (PFA) la nuit pour une analyse histologique. </li></ol> 2. Évaluation de la rétine Neuron Dommages Utilisation TUNEL STaining <ol><li> Pour quantifier les cellules apoptotiques dans la montagne toute retinasuse le dosage désoxynucléotidyl transférase terminale médiation dUTP nick-étiquetage (TUNEL), selon les instructions du fabricant. </li><li> On dissèque la rétine de l&#39;oeillère, pour laver 3 x 5 minutes dans 0,3% de Triton X-100 dans du tampon phosphate salin (PBS-T). </li><li> Perméabiliser le tissu dans 3% de T-PBS pendant 2 heures. </li><li> Pré-équilibrer rétines en tampon d&#39;équilibration pendant 10 minutes, avant l&#39;incubation dans une solution de réaction TUNEL pendant 1 heure à 37 ° C. </li><li> Laver le tissu pour 3 x 5 min dans 0,3% T-PBS, rincer à 0,3% T-PBS contenant 5 uM DAPI, et plate-monter dans les médias de montage. </li><li> Pour quantifier noyaux positifs TUNEL utilisent un microscope confocal à prendre 10 um z-piles à travers la couche de cellules ganglionnaires à 20X. Prendre trois images sur chacun des quatre pétales, sur des sites proches du nerf optique, dans la mi-périphérie, et à la périphérie loin de la rétine, ce qui donne un total de 12 images par moun ensemblet, échantillonnage environ 7000 cellules. Critères morphologiques non discrimination neuronale des cellules (endothéliales et des cellules gliales) à partir de cellules neuronales. </li><li> Certaines zones pour l&#39;imagerie en utilisant uniquement le canal de DAPI, et les enquêteurs de masque à des groupes de traitement. </li></ol> 3. évaluer les dommages du nerf optique utilisant Bleu de Toluidine Coloration <ol><li> Fixer nerfs optiques nuit dans une solution de Karnovsky à 4 ° C. </li><li> Traiter les échantillons pendant 2 heures à 1% (p / v) de tétroxyde d&#39;osmium, puis déshydrater dans 100% d&#39;éthanol. </li><li> Incuber nerfs optiques en oxyde de propylène pendant 30 min, et le placer dans un mélange 50:50 d&#39;oxyde de propylène: nuit araldite. </li><li> Modifier cette solution à 100% araldite, suivie d&#39;une incubation pendant une nuit à 60 ° C. </li><li> sections coupées semithin (0,75 mm d&#39;épaisseur) et tache avec 1% toluidine bleu / borax (TB) dans 50% d&#39;éthanol avant l&#39;examen par microscopie optique. </li></ol> 4. Analyse statistique <ol><li> Effectuer ana statistiqueslyse en utilisant un logiciel de statistiques appropriés. Une ANOVA à deux voies avec le test post-hoc de Newman-Keul peut être utilisée pour calculer la signification statistique pour la PIO change au fil du temps. </li><li> Une valeur de p inférieure à 0,05 peut être considéré comme significatif. </li></ol>

<ol>
	<li>Quigley, H. A., Broman, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+number+of+people+with+glaucoma+worldwide+in+2010+and+2020.">The number of people with glaucoma worldwide in 2010 and 2020.</a> Br J Ophthalmol. 90 (3), 262-267 (2006).</li><li>Weinreb, R. N., Aung, T., Medeiros, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pathophysiology+and+treatment+of+glaucoma:+a+review.">The pathophysiology and treatment of glaucoma: a review.</a> JAMA. 311 (18), 1901-1911 (2014).</li><li>Samsel, P. A., Kisiswa, L., Erichsen, J. T., Cross, S. D., Morgan, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+method+for+the+induction+of+experimental+glaucoma+using+magnetic+microspheres.">A novel method for the induction of experimental glaucoma using magnetic microspheres.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 52 (3), 1671-1675 (2011).</li><li>Libby, R. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inherited+glaucoma+in+DBA/2J+mice:+pertinent+disease+features+for+studying+the+neurodegeneration.">Inherited glaucoma in DBA/2J mice: pertinent disease features for studying the neurodegeneration.</a> Vis Neurosci. 22 (5), 637-648 (1017).</li><li>Morrison, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elevated+intraocular+pressure+and+optic+nerve+injury+models+in+the+rat.">Elevated intraocular pressure and optic nerve injury models in the rat.</a> J Glaucoma. 14 (4), 315-317 (2005).</li><li>Levkovitch-Verbin, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translimbal+laser+photocoagulation+to+the+trabecular+meshwork+as+a+model+of+glaucoma+in+rats.">Translimbal laser photocoagulation to the trabecular meshwork as a model of glaucoma in rats.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 43 (2), 402-410 (2002).</li><li>Moore, C. G., Johnson, E. C., Morrison, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+rhythm+of+intraocular+pressure+in+the+rat.">Circadian rhythm of intraocular pressure in the rat.</a> Curr Eye Res. 15 (2), 185-191 (1996).</li><li>Morrison, J. C., Jia, L., Cepurna, W., Guo, Y., Johnson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reliability+and+sensitivity+of+the+TonoLab+rebound+tonometer+in+awake+Brown+Norway+rats.">Reliability and sensitivity of the TonoLab rebound tonometer in awake Brown Norway rats.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 50 (6), 2802-2808 (2009).</li><li>Wang, W. H., Millar, J. C., Pang, I. H., Wax, M. B., Clark, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+measurement+of+rodent+intraocular+pressure+with+a+rebound+tonometer.">Noninvasive measurement of rodent intraocular pressure with a rebound tonometer.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 46 (12), 4617-4621 (2005).</li><li>Isenberg, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ocular+application+of+povidone-iodine.">The ocular application of povidone-iodine.</a> Community Eye Health. 16 (46), 30-31 (2003).</li><li>Morrison, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rat+model+of+chronic+pressure-induced+optic+nerve+damage.">A rat model of chronic pressure-induced optic nerve damage.</a> Exp Eye Res. 64 (1), 85-96 (1997).</li><li>Foxton, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VEGF-A+is+necessary+and+sufficient+for+retinal+neuroprotection+in+models+of+experimental+glaucoma.">VEGF-A is necessary and sufficient for retinal neuroprotection in models of experimental glaucoma.</a> Am J Pathol. 182 (4), 1379-1390 (2013).</li></ol>

David T. Shima is an employee of Hofmann-La Roche, Switzerland. The remaining authors declare they have no competing financial interests.

Nous démontrons ici un procédé pour induire une élévation de la PIO chez le rat, par injection de microsphères magnétiques dans la chambre antérieure de l&#39;oeil. Cette méthode est simple à réaliser et nécessite peu d&#39;expertise chirurgicale, ou les heures de pratique et de raffinement. En outre, la procédure est efficace; rarement nécessitant plus d&#39;une injection unique de perles pour induire une forte hausse robuste de la pression (taux de réinjection d&#39;environ 10%). Cela peut fournir un avantage par rapport aux méthodes existantes inductibles, tels que la veine episceral techniquement difficile sclérose 11 modèle, ou un laser de photocoagulation protocole 6, qui peut nécessiter plusieurs procédures pour maintenir soulevées PIO. Pour la méthode pour réussir cependant, il ya quelques petites étapes critiques qui doivent être prises. Tout d&#39;abord, il est utile d&#39;utiliser un aimant de forme toroïdale de tirer des billes dans l&#39;angle irido-cornéen. Cette étape est une modification du protocole d&#39;origine, where les billes ont été injectées dans la chambre antérieure, puis déplacé à main levée autour de l&#39;œil 3. Utilisant un aimant toroïdal signifie que microsphères doivent régler uniformément autour de l&#39;angle, ce qui nécessite une redistribution manuelle minimale. Deuxièmement, le taux d&#39;injection doit être rapide - trop lent et les perles sera principalement accumuler sur un côté de l&#39;angle, conduisant à une couverture incomplète, et potentiellement pas d&#39;augmentation de la pression. D&#39;une manière générale cependant, le procédé est assez simple que l&#39;utilisateur puisse facilement faire des modifications du protocole, comme la variation de la taille ou le volume des particules de microsphères, peut-être pour tenter de modifier le degré d&#39;élévation de la PIO. Cependant, un inconvénient potentiel de la méthode est que l&#39;on a peu de contrôle sur l&#39;étendue de la l&#39;hypertension, qui à environ 5-10% des cas que nous avons observés a augmenté de plus de 60 mmHg. Hausses excessives des PIO peuvent être très destructeur pour le tissu de la rétine, et peuvent faire l&#39;étude des mécanismes et biologie de la mort cellulaire contester. Cependant, le procédé produit une pathologie neuronale cohérente, à la fois dans la rétine et du nerf optique, qui peut être manipulé 12 pharmacologiquement. Cela peut rendre le modèle attractif pour le développement de nouvelles thérapies pour traiter le glaucome. En outre, parce que les billes sont dirigés dans l&#39;angle irido-cornéen, ce qui laisse libre l&#39;axe visuel pour l&#39;imagerie en temps réel du disque optique ou de la rétine. Nous prévoyons que ce modèle sera adapté et utilisé pour des applications futures dans d&#39;autres espèces, y compris les souris.

Glaucome primaire est une maladie oculaire dévastatrice qui touche environ 60,5 millions de personnes dans le monde 1, qui peut conduire à modifier la vie perte de vision et la cécité 2. La recherche sur les mécanismes de la maladie, et le développement de nouveaux traitements pour le glaucome, sont tributaires de bons modèles de la maladie qui récapitulent certaines des caractéristiques de la pathologie. Nous présentons ici un modèle de glaucome de rat selon la méthode des Samsel et al. 3 L&#39;objectif global de cette technique est d&#39;augmenter la pression intraoculaire (PIO) dans l&#39;oeil en injectant microsphères magnétiques dans la chambre antérieure, et en utilisant un anneau magnétique, directe les dans l&#39;angle iridocornéen. Cela empêche l&#39;écoulement aqueux, ce qui augmente la PIO, conduisant à des lésions neuronales et la perte de cellules. Le protocole a été mis au point pour tenter de fournir un modèle simple inductible du glaucome. Ce protocole peut avoir certains avantagespar rapport aux techniques existantes. Des modèles de souris génétiques tels que la souris DBA / 2J sont disponibles, qui ne nécessitent pas de procédures d&#39;ouverture; cependant ceux-ci peuvent avoir une apparition aléatoire de progression de la maladie 4. En revanche, les modèles inductibles, dont la plupart se appuient sur l&#39;élévation de la PIO chez les rongeurs chirurgicalement, ont l&#39;avantage que l&#39;initiation peut être commandé par l&#39;utilisateur. Certaines de ces méthodes peuvent avoir des inconvénients de leur propre cependant, notamment en étant techniquement difficile 5, et peut nécessiter plusieurs procédures pour maintenir une PIO élevée 6. En revanche, la méthode inductible détaillé dans ce manuscrit est une technique simple, efficace et reproductible qui produit stables, de fortes hausses de la pression, avec un besoin minimum de réinjection. En outre, il ne se agit pas de matériel coûteux, et ne exige des compétences chirurgicales de base à effectuer. Ce protocole peut être approprié pour les lecteurs qui cherchent à mettre en place un inductible exigeante techniquement moinsmodèle de glaucome dans leur laboratoire.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="784">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:324px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:175px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:324px;">250-300g female Brown Norway ex-breeder rats</td>
			<td style="width:175px;">Harlan UK</td>
			<td style="width:119px;">203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:324px;">Tonolab Rebound Tonometer</td>
			<td style="width:175px;">Tiolat</td>
			<td style="width:119px;">TV02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:324px;">Ketaset (Ketamine)</td>
			<td style="width:175px;">Fort Dodge Animal health</td>
			<td>BN1000118</td>
			<td>37.5 mg/kg</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:324px;">Domitor (medetomidine hydrochloride)</td>
			<td style="width:175px;">Orion Pharma</td>
			<td style="width:119px;">140-999</td>
			<td>0.25 mg/kg</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:324px;">Povidone iodine</td>
			<td style="width:175px;">Ecolab</td>
			<td>BN4369LE10</td>
			<td>5% in H2O</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:324px;">Minim&#39;s Saline Solution</td>
			<td style="width:175px;">Bausch and Lomb</td>
			<td>PL00033/5017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:324px;">Toroidal magnet</td>
			<td style="width:175px;">Supermagnete</td>
			<td>R-10-07-03-N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:324px;">Magnetic Microspheres</td>
			<td style="width:175px;">Bangs Laboratories</td>
			<td>UMC4N/9692</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:324px;">HBSS</td>
			<td style="width:175px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">14025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:324px;">33-guage bevelled needle</td>
			<td style="width:175px;">Hamilton</td>
			<td>7747-01</td>
			<td>Custom needle</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:324px;">Luer tip syringe</td>
			<td style="width:175px;">Hamilton</td>
			<td>80601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:324px;">Antisedan (atipemezole hydrochloride )</td>
			<td style="width:175px;">Orion Pharma</td>
			<td style="width:119px;">141-003</td>
			<td>0.25 mg/kg</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:324px;">Chloramphenicol ointment</td>
			<td style="width:175px;">Medicom</td>
			<td>18956-0005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:324px;">TUNEL staining kit</td>
			<td style="width:175px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">G3250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:324px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:175px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:324px;">DAPI</td>
			<td style="width:175px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D9542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:324px;">Vectashield Mounting Media</td>
			<td style="width:175px;">Vector Labs</td>
			<td style="width:119px;">H-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

experimental glaucoma induced by ocular injection of magnetic microspheres

Progress in understanding the pathophysiology, and providing novel treatments for glaucoma is dependent on good animal models of the disease. We present here a protocol for elevating intraocular pressure (IOP) in the rat, by injecting magnetic microspheres into the anterior chamber of the eye. The use of magnetic particles allows the user to manipulate the beads into the iridocorneal angle, thus providing a very effective blockade of fluid outflow from the trabecular meshwork. This leads to long-lasting IOP rises, and eventually neuronal death in the ganglion cell layer (GCL) as well as optic nerve pathology, as seen in patients with the disease. This method is simple to perform, as it does not require machinery, specialist surgical skills, or many hours of practice to perfect. Furthermore, the pressure elevations are very robust, and reinjection of the magnetic microspheres is not usually required unlike in some other models using plastic beads. Additionally, we believe this method is suitable for adaptation for the mouse eye.

L&#39;injection de billes magnétiques dans l&#39;angle iridocornéen systématiquement induit une hausse prolongée et robuste de la pression (Figure 1), qui était facilement observable au premier point de temps, trois jours après l&#39;injection. En outre, l&#39;augmentation de la pression a été maintenue pendant toute la durée de l&#39;expérience, et bien que notre cours de temps a fini à 18 jours post-injection, d&#39;autres ont signalé que la pression persiste à long terme 3. La PIO moyenne en moyenne sur toute la longueur de l&#39;expérience pour le contrôle, les yeux non-perles-injectés était de 19,7 ± 0,3 mmHg, comparativement à 40,5 ± 2,8 mmHg pour les yeux de perles-injecté (P &lt;0,001). En outre, le pic est passé de la PIO 22,8 ± 0,3 mmHg à 49,9 ± 2,3 mmHg. Pour déterminer si l&#39;élévation de la PIO conduit à la mort des cellules ganglionnaires de la rétine, nous avons effectué une coloration TUNEL sur des rétines, et l&#39;histologie sur des sections transversales des nerfs optiques (figure 2). Dans la rétine<html> nous avons observé une augmentation de la coloration TUNEL (figure 2A) dans les yeux de talon injecté avec une PIO élevée. Le nombre de noyaux apoptotiques a augmenté d&#39;environ 15 fois, de 1,6 ± 0,5 dans des cellules témoins controlatéraux, à 24,5 ± 0,5 cellules de rétines hypertendus (Figure 2B, p &lt;0,05). En outre, dans les yeux, dans lequel des billes magnétiques ont été injectés mais la pression ne ont pas augmenté (probablement en raison de l&#39;obstruction incomplète de l&#39;angle iridocornéen), le nombre de cellules TUNEL-positives ne étaient pas significativement différentes de celles des contrôles non-injecté (P&gt; 0,05). Cela donne à penser que la mort cellulaire est liée à la pression augmente, pas en raison de la toxicité directe des microsphères magnétiques. Enfin, nous avons étudié la pathologie du nerf optique dans le modèle de glaucome, et vu accumulation de bleu de toluidine dans de nombreux axones, ce qui indique une dégénérescence de ces processus cellulaires (figure 2C). ure 1 &quot;src =&quot; / files / ftp_upload / 52400 / 52400fig1highres.jpg &quot;/&gt; Figure 1. L&#39;élévation de la pression intra-oculaire en utilisant des microsphères magnétiques. Injection de microsphères magnétiques dans la chambre antérieure a induit une robuste augmentation significative de la pression intraoculaire (PIO) par rapport au contrôle controlatéral, les yeux non-injecté. Unités de l&#39;axe Y = millimètres de mercure (mmHg). Données = moyenne ± SEM. * = P &lt;0,001; N = 12. Ce chiffre a été modifié depuis Foxton et al, Am.. J. Pathol 182 (4):. 1379-1390. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/52400/52400fig2highres.jpg" /> Figure 2. L&#39;élévation de la PIO par injection de microsphères magnétiques dans l&#39;angle irido-cornéen, la mort neuronale induite dans la couche de cellules ganglionnaires (GCL). (A) des images représentatifs de rétines de contrôle (à gauche) et le glaucome (à droite) yeux colorés pour les noyaux apoptotiques par TUNEL (vert;flèches blanches) et DAPI (bleu), indiquant le nombre de noyaux apoptotiques augmenté que PIO Rose. (B) Quantification des cellules positives TUNEL dans le GCL, montrant que les yeux avec une PIO élevée (au milieu), avaient des cellules beaucoup plus apoptotiques en comparaison le contrôle (à gauche). En revanche, dans les yeux de perles injecté où la pression ne monte pas (à droite), a été observé aucune augmentation significative de la coloration TUNEL. Données = moyenne ± SEM. * = P &lt;0,05; N = 7-8 (C) des images représentatives de la coloration du nerf optique, démontrant une augmentation de l&#39;accumulation bleu de toluidine (flèches noires) dans les axones endommagés de glaucome (à droite), mais pas contrôler yeux (à gauche).. Barres d&#39;échelle = 50 um. Ce chiffre a été modifié depuis Foxton et al., Am. J. Pathol 182 (4):. 1379-1390.

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Experimental Glaucoma Induced by Ocular Injection of Magnetic Microspheres

We present a method for inducing elevated intraocular pressure (IOP), by injecting magnetic microspheres into the rat eye, to model glaucoma. This leads to strong pressure rises, and extensive neuronal death. This protocol is easy to perform, does not require repeat injections, and produces stable long-lasting IOP rises.

Glaucome Expérimental induite par l&#39;injection oculaire de microsphères magnétiques

Progress in understanding the pathophysiology, and providing novel treatments for glaucoma is dependent on good animal models of the disease. We present ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

16.9K vues.  University College London Institute of Ophthalmology. We present a method for inducing elevated intraocular pressure (IOP), by injecting magnetic microspheres into the rat eye, to model glaucoma. This leads to strong pressure rises, and extensive neuronal death. This protocol is easy to perform, does not require repeat injections, and produces stable long-lasting IOP rises.

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Generation of Alginate Microspheres for Biomedical Applications

Alginate-based materials have received considerable attention for biomedical applications because of their hydrophilic nature, biocompatibility, and physical architecture. Applications include cell encapsulation, drug delivery, stem cell culture, and tissue engineering scaffolds. In fact, clinical trials are currently being performed in which islets are encapsulated in PLO coated alginate microbeads as a treatment of type I diabetes. However, large numbers of islets are required for efficacy due to poor survival following transplantation. The ability to locally stimulate microvascular network formation around the encapsulated cells may increase their viability through improved transport of oxygen, glucose and other vital nutrients. Fibroblast growth factor-1 (FGF-1) is a naturally occurring growth factor that is able to stimulate blood vessel formation and improve oxygen levels in ischemic tissues. The efficacy of FGF-1 is enhanced when it is delivered in a sustained fashion rather than a single large-bolus administration. The local long-term release of growth factors from islet encapsulation systems could stimulate the growth of blood vessels directly towards the transplanted cells, potentially improving functional graft outcomes. In this article, we outline procedures for the preparation of alginate microspheres for use in biomedical applications. In addition, we describe a method we developed for generating multilayered alginate microbeads. Cells can be encapsulated in the inner alginate core, and angiogenic proteins in the outer alginate layer. The release of proteins from this outer layer would stimulate the formation of local microvascular networks directly towards the transplanted islets.

In the following sections, we outline procedures for the preparation of alginate microspheres for use in biomedical applications. We specifically illustrate a technique for creating multilayered alginate microspheres for the dual purpose of cell and protein encapsulation as a potential treatment for type 1 diabetes.

Génération d&#39;alginate de microsphères pour des applications biomédicales

Alginate-based materials have received considerable attention for biomedical applications because of their hydrophilic nature, biocompatibility, and ...

Recherche

Médecine

Subretinal Injection of Gene Therapy Vectors and Stem Cells in the Perinatal Mouse Eye

The loss of sight affects approximately 3.4 million people in the United States and is expected to increase in the upcoming years.1 Recently, gene therapy and stem cell transplantations have become key therapeutic tools for treating blindness resulting from retinal degenerative diseases. Several forms of autologous transplantation for age-related macular degeneration (AMD), such as iris pigment epithelial cell transplantation, have generated encouraging results, and human clinical trials have begun for other forms of gene and stem cell therapies.2 These include RPE65 gene replacement therapy in patients with Leber's congenital amaurosis and an RPE cell transplantation using human embryonic stem (ES) cells in Stargardt's disease.3-4 Now that there are gene therapy vectors and stem cells available for treating patients with retinal diseases, it is important to verify these potential therapies in animal models before applying them in human studies. The mouse has become an important scientific model for testing the therapeutic efficacy of gene therapy vectors and stem cell transplantation in the eye.5-8 In this video article, we present a technique to inject gene therapy vectors or stem cells into the subretinal space of the mouse eye while minimizing damage to the surrounding tissue.

This surgical technique illustrates the injection of gene therapy vectors and stem cells into the subretinal space of the mouse eye.

Injection sous-rétinien de vecteurs de thérapie génique et les cellules souches dans l&#39;œil de la souris

The loss of sight affects approximately 3.4 million people in the United States and is expected to increase in the upcoming years.1 Recently, gene therapy ...

A Laser-induced Mouse Model of Chronic Ocular Hypertension to Characterize Visual Defects

Glaucoma, frequently associated with elevated intraocular pressure (IOP), is one of the leading causes of blindness. We sought to establish a mouse model of ocular hypertension to mimic human high-tension glaucoma. Here laser illumination is applied to the corneal limbus to photocoagulate the aqueous outflow, inducing angle closure. The changes of IOP are monitored using a rebound tonometer before and after the laser treatment. An optomotor behavioral test is used to measure corresponding changes in visual capacity. The representative result from one mouse which developed sustained IOP elevation after laser illumination is shown. A decreased visual acuity and contrast sensitivity is observed in this ocular hypertensive mouse. Together, our study introduces a valuable model system to investigate neuronal degeneration and the underlying molecular mechanisms in glaucomatous mice.

Chronic ocular hypertension is induced using laser photocoagulation of the trabecular meshwork in mouse eyes. The intraocular pressure (IOP) is elevated for several months after laser treatment. The decrease of visual acuity and contrast sensitivity of experimental animals are monitored using the optomotor test.

Un modèle de souris induite par laser de l&#39;hypertension oculaire chronique pour caractériser les défauts d&#39;apparence

Glaucoma, frequently associated with elevated intraocular pressure (IOP), is one of the leading causes of blindness. We sought to establish a mouse model ...

Retinal Detachment Model in Rodents by Subretinal Injection of Sodium Hyaluronate

Subretinal injection of sodium hyaluronate is a widely accepted method of inducing retinal detachment (RD). However, the height and duration of RD or the occurrence of subretinal hemorrhage can affect photoreceptor cell death in the detached retina. Hence, it is advantageous to create reproducible RDs without subretinal hemorrhage for evaluating photoreceptor cell death. We modified a previously reported method to create bullous and persistent RDs in a reproducible location with rare occurrence of subretinal hemorrhage. The critical step of this modified method is the creation of a self-sealing scleral incision, which can prevent leakage of sodium hyaluronate after injection into the subretinal space. To make the self-sealing scleral incision, a scleral tunnel is created, followed by scleral penetration into the choroid with a 30 G needle. Although choroidal hemorrhage may occur during this step, astriction with a surgical spear reduces the rate of choroidal hemorrhage. This method allows a more reproducible and reliable model of photoreceptor death in diseases that involve RD such as rhegmatogenous RD, retinopathy of prematurity, diabetic retinopathy, central serous chorioretinopathy, and age-related macular degeneration (AMD).

Creating experimental retinal detachments with a reproducible and sustained height of detachment, and without subretinal hemorrhage, is important for studying the pathophysiology of photoreceptor cell loss in retinal disease and evaluating potential therapeutic interventions. Here, we report such a method in detail.

Décollement de la rétine modèle chez les rongeurs par injection sous-rétinienne de hyaluronate de sodium

Subretinal injection of sodium hyaluronate is a widely accepted method of inducing retinal detachment (RD). However, the height and duration of RD or the ...

Noninvasive Assessment of Cardiac Abnormalities in Experimental Autoimmune Myocarditis by Magnetic Resonance Microscopy Imaging in the Mouse

Myocarditis is an inflammation of the myocardium, but only ~10% of those affected show clinical manifestations of the disease. To study the immune events of myocardial injuries, various mouse models of myocarditis have been widely used. This study involved experimental autoimmune myocarditis (EAM) induced with cardiac myosin heavy chain (Myhc)-&#945; 334-352 in A/J mice; the affected animals develop lymphocytic myocarditis but with no apparent clinical signs. In this model, the utility of magnetic resonance microscopy (MRM) as a non-invasive modality to determine the cardiac structural and functional changes in animals immunized with Myhc-&#945; 334-352 is shown. EAM and healthy mice were imaged using a 9.4 T (400 MHz) 89 mm vertical core bore scanner equipped with a 4 cm millipede radio-frequency imaging probe and 100 G/cm triple axis gradients. Cardiac images were acquired from anesthetized animals using a gradient-echo-based cine pulse sequence, and the animals were monitored by respiration and pulse oximetry. The analysis revealed an increase in the thickness of the ventricular wall in EAM mice, with a corresponding decrease in the interior diameter of ventricles, when compared with healthy mice. The data suggest that morphological and functional changes in the inflamed hearts can be non-invasively monitored by MRM in live animals. In conclusion, MRM offers an advantage of assessing the progression and regression of myocardial injuries in diseases caused by infectious agents, as well as response to therapies.

This study demonstrates the successful establishment of magnetic resonance microscopy imaging as a non-invasive tool to assess the cardiac abnormalities in mice affected with autoimmune myocarditis. The data indicate that the technique can be used to monitor the disease-progression in live animals.

Évaluation non invasive de la Cardiac Malformations en auto-immune expérimentale myocardite par résonance magnétique microscopie imagerie chez la souris

Myocarditis is an inflammation of the myocardium, but only ~10% of those affected show clinical manifestations of the disease. To study the immune events ...

A Magnetic Microbead Occlusion Model to Induce Ocular Hypertension-Dependent Glaucoma in Mice

The use of rodent models of glaucoma has been essential to understand the molecular mechanisms that underlie the pathophysiology of this multifactorial neurodegenerative disease. With the advent of numerous transgenic mouse lines, there is increasing interest in inducible murine models of ocular hypertension. Here, we present an occlusion model of glaucoma based on the injection of magnetic microbeads into the anterior chamber of the eye using a modified microneedle with a facetted bevel. The magnetic microbeads are attracted to the iridocorneal angle using a handheld magnet to block the drainage of aqueous humour from the anterior chamber. This disruption in aqueous dynamics results in a steady elevation of intraocular pressure, which subsequently leads to the loss of retinal ganglion cells, as observed in human glaucoma patients. The microbead occlusion model presented in this manuscript is simple compared to other inducible models of glaucoma and also highly effective and reproducible. Importantly, the modifications presented here minimize common issues that often arise in occlusion models. First, the use of a bevelled glass microneedle prevents backflow of microbeads and ensures that minimal damage occurs to the cornea during the injection, thus reducing injury-related effects. Second, the use of magnetic microbeads ensures the ability to attract most beads to the iridocorneal angle, effectively reducing the number of beads floating in the anterior chamber avoiding contact with other structures (e.g., iris, lens). Lastly, the use of a handheld magnet allows flexibility when handling the small mouse eye to efficiently direct the magnetic microbeads and ensure that there is little reflux of the microbeads from the eye when the microneedle is withdrawn. In summary, the microbead occlusion mouse model presented here is a powerful investigative tool to study neurodegenerative changes that occur during the onset and progression of glaucoma.

Here, we present a protocol to induce ocular hypertension in the murine eye that results in the loss of retinal ganglion cells as observed in glaucoma. Magnetic microbeads are injected into the anterior chamber and attracted to the iridocorneal angle using a magnet to block the outflow of aqueous humour.

A Magnetic Microbead Occlusion Modèle à Provoquer Ocular Hypertension dépendante Glaucome chez la souris

The use of rodent models of glaucoma has been essential to understand the molecular mechanisms that underlie the pathophysiology of this multifactorial ...

Regenerative Therapy by Suprachoroidal Cell Autograft in Dry Age-related Macular Degeneration: Preliminary In Vivo Report

This study is aimed at examining whether a suprachoroidal graft of autologous cells can improve best corrected visual acuity (BCVA) and responses to microperimetry (MY) in eyes affected by dry Age-related Macular Degeneration (AMD) over time through the production and secretion of growth factors (GFs) on surrounding tissue. Patients were randomly assigned to each study group. All patients were diagnosed with dry AMD and with BCVA equal to or greater than 1 logarithm of the minimum angle of resolution (logMAR). A suprachoroidal autologous graft by Limoli Retinal Restoration Technique (LRRT) was carried out on group A, which included 11 eyes from 11 patients. The technique was performed by implanting adipocytes, adipose-derived stem cells obtained from the stromal vascular fraction, and platelets from platelet-rich plasma in the suprachoroidal space. Conversely, group B, including 14 eyes of 14 patients, was used as a control group. For each patient, diagnosis was verified by confocal scanning laser ophthalmoscope and spectral domain-optical coherence tomography (SD-OCT). In group A, BCVA improved by 0.581 to 0.504 at 90 days and to 0.376 logMAR at 180 days (+32.20%) postoperatively. Furthermore, MY test increased by 11.44 dB to 12.59 dB at 180 days. The different cell types grafted behind the choroid were able to ensure constant GF secretion in the choroidal flow. Consequently, the results indicate that visual acuity (VA) in the grafted group can increase more than in the control group after six months.

Regenerative Therapy by Suprachoroidal Cell Autograft in Dry Age-related Macular Degeneration: Preliminary In Vivo Report

The goal of this study is to assess whether the suprachoroidal graft of adipose-derived stem cells included in the stromal vascular fraction and platelets derived from platelet-rich plasma by the Limoli Retinal Restoration Technique can improve visual acuity and retinal sensitivity responses in eyes affected by dry age-related macular degeneration.

Une thérapie régénératrice par autogreffe de cellules Suprachoroidal à sec Age-related Macular Degeneration : préliminaire In Vivo rapport

This study is aimed at examining whether a suprachoroidal graft of autologous cells can improve best corrected visual acuity (BCVA) and responses to ...

An Experimental Model of Diet-Induced Metabolic Syndrome in Rabbit: Methodological Considerations, Development, and Assessment

In recent years, obesity and metabolic syndrome (MetS) have become a growing problem for public health and clinical practice, given their increased prevalence due to the rise of sedentary lifestyles and unhealthy eating habits. Thanks to animal models, basic research can investigate the mechanisms underlying pathological processes such as MetS. Here, we describe the methods used to develop an experimental rabbit model of diet-induced MetS and its assessment. After a period of acclimation, animals are fed a high-fat (10% hydrogenated coconut oil and 5% lard), high-sucrose (15% sucrose dissolved in water) diet for 28 weeks. During this period, several experimental procedures were performed to evaluate the different components of MetS: morphological and blood pressure measurements, glucose tolerance determination, and the analysis of several plasma markers. At the end of the experimental period, animals developed central obesity, mild hypertension, pre-diabetes, and dyslipidemia with low HDL, high LDL, and an increase of triglyceride (TG) levels, thus reproducing the main components of human MetS. This chronic model allows new perspectives for understanding the underlying mechanisms in the progression of the disease, the detection of preclinical and clinical markers that allow the identification of patients at risk, or even the testing of new therapeutic approaches for the treatment of this complex pathology.

We describe methods to develop an experimental model of diet-induced metabolic syndrome (MetS) in rabbits using a high-fat, high-sucrose diet. Animals developed central obesity, mild hypertension, pre-diabetes, and dyslipidemia, thus reproducing the main components of human MetS. This chronic model will allow acquisition of knowledge underlying mechanisms of disease progression.

Un modèle expérimental du Syndrome métabolique induite par l’alimentation chez le lapin : considérations méthodologiques, développement et évaluation

In recent years, obesity and metabolic syndrome (MetS) have become a growing problem for public health and clinical practice, given their increased ...

A Model of Glaucoma Induced by Circumlimbal Suture in Rats and Mice

The circumlimbal suture is a technique for inducing experimental glaucoma in rodents by chronically elevating intraocular pressure (IOP), a well-known risk factor for glaucoma. This protocol demonstrates a step-by-step guide on this technique in Long Evans rats and C57BL/6 mice. Under general anesthesia, a "purse-string" suture is applied on the conjunctiva, around the equator and behind the limbus of the eye. The fellow eye serves as an untreated control. Over the duration of our study, which was a period of 8 weeks for rats and 12 weeks for mice, IOP remained elevated, as measured regularly by rebound tonometry in conscious animals without topical anesthesia. In both species, the sutured eyes showed electroretinogram features consistent with preferential inner retinal dysfunction. Optical coherence tomography showed selective thinning of the retinal nerve fiber layer. Histology of the rat retina in cross-section found reduced cell density in the ganglion cell layer, but no change in other cellular layers. Staining of flat-mounted mouse retinae with a ganglion cell specific marker (RBPMS) confirmed ganglion cell loss. The circumlimbal suture is a simple, minimally invasive and cost-effective way to induce ocular hypertension that leads to ganglion cell injury in both rats and mice.

Chronic ocular hypertension is induced by applying a circumlimbal suture in rats and mice, leading to functional and structural deterioration of the retinal ganglion cells consistent with glaucoma.

Un modèle de glaucome induit par la Suture Circumlimbal chez le rat et la souris

The circumlimbal suture is a technique for inducing experimental glaucoma in rodents by chronically elevating intraocular pressure (IOP), a well-known ...

A Rabbit Model of Aqueous-Deficient Dry Eye Disease Induced by Concanavalin A Injection into the Lacrimal Glands: Application to Drug Efficacy Studies

Dry eye disease (DED), a multifactorial inflammatory disease of the ocular surface, affects 1 in 6 humans worldwide with staggering implications for quality of life and health care costs. The lack of informative animal models that recapitulate its key features impedes the search for new therapeutic agents for DED. Available DED animal models have limited reproducibility and efficacy. A model is presented here in which DED is induced by injecting the mitogen concanavalin A (Con A) into the orbital lacrimal glands of rabbits. Innovative aspects of this model are the use of ultrasound (US) guidance to ensure optimal and reproducible injection of Con A into the inferior lacrimal gland; injection of Con A into all orbital lacrimal glands that limits compensatory production of tears; and use of periodic repeat injections of Con A that prolong the state of DED at will. DED and its response to test agents are monitored with a panel of parameters that assess tear production, the stability of the tear film, and the status of the corneal and conjunctival mucosa. They include tear osmolarity, tear break-up time, Schirmer&#39;s tear test, rose bengal staining, and tear lactoferrin levels. The induction of DED and the monitoring of its parameters are described in detail. This model is simple, robust, reproducible, and informative. This animal model is suitable for the study of tear physiology and of the pathophysiology of DED as well as for the assessment of the efficacy and safety of candidate agents for the treatment of DED.

This article describes the development of a method to induce acute or chronic dry eye disease in rabbits by injecting concanavalin A to all portions of the orbital lacrimal gland system. This method, superior to those already reported, generates a reproducible, stable model of dry eye suitable for the study of pharmacological agents.

Un modèle de lapin de la maladie sèche aqueuse-déficiente d'oeil induite par concanavalin une injection dans les glandes lacrimal : application aux études d'efficacité de drogue

Dry eye disease (DED), a multifactorial inflammatory disease of the ocular surface, affects 1 in 6 humans worldwide with staggering implications for ...